开封地区奶牛隐孢子虫种类及基因型鉴定

赵金凤，齐 萌，王海燕，化 军，张 娜，张昆坡，李俊强，刘 群

开封地区奶牛隐孢子虫种类及基因型鉴定

赵金凤1,2，齐 萌2，王海燕3，化 军3，张 娜2，张昆坡2，李俊强2，刘 群1

目的 探讨开封地区奶牛隐孢子虫感染情况和种类分布。方法 采用饱和蔗糖溶液漂浮法检查新鲜粪便样本的隐孢子虫卵囊，用18S rRNA基因对隐孢子虫进行PCR扩增和限制性片段长度多态性分析；基于gp60基因位点对微小隐孢子虫进行基因亚型鉴定。结果 粪便样本中隐孢子虫阳性率为8.4% (52/622)，不同调查点、年龄段和养殖条件下奶牛隐孢子虫感染率具有统计学意义(P<0.01)。基于18S rRNA基因位点成功扩增出50个样本，分别经SspI和MboII酶切进行鉴定，发现安氏隐孢子虫为优势虫种，为23份，微小隐孢子虫、牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫分别为5份、12份和6份，4份为牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫混合感染。序列分析显示5个微小隐孢子虫均为人兽共患基因亚型IIdA19G1。结论 开封地区奶牛感染人兽共患微小隐孢子虫基因亚型，具有人兽共患传播的可能性。

隐孢子虫；基因型；鉴定；奶牛

ZHANG Kun-po2,LI Jun-qiang2,LIU Qun1

隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种重要的人兽共患肠道原虫，目前有27个种和70多个基因型，多数虫种和基因型具有宿主特异性，对自然宿主的致病性也存在较大差异[1-3]。牛是人类隐孢子虫病的重要传染源，常见寄生于牛的有微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)，安氏隐孢子虫(C.andersoni)，牛隐孢子虫(C.bovis)和芮氏隐孢子虫(C.ryanae)，牛还可感染其它10个隐孢子虫虫种/基因型[1,4]。其中，微小隐孢子虫(C.parvum)主要引起未断奶犊牛严重腹泻甚至死亡，并可导致包括人在内的多种脊椎动物腹泻；安氏隐孢子虫主要引起断奶后牛胃粘膜损伤和萎缩；牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫尚未发现明显致病性[5]。

依据形态学观察，安氏隐孢子虫与其他3种隐孢子虫易于区分，而微小隐孢子虫、牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫通过显微镜观察难以区分。Feng等[6]建立了基于SspI和MboII限制性内切酶的PCR-RFLP能有效区分该4种隐孢子虫，现常用于牛隐孢子虫种类的分布研究。微小隐孢子虫是3种重要的人兽共患隐孢子虫之一，但并非所有微小隐孢子虫分离株均可在人和动物之间进行传播，基因亚型分析工具常用于隐孢子虫群体遗传结构鉴定和人兽共患风险评价[7-8]。目前微小隐孢子虫基于gp60基因分为IIa-l共11个亚型家族，IIa和IId亚型家族可在人和反刍动物之间传播，而IIc和IIe亚型家族仅通过人-人途径传播，其它亚型家族多具有宿主特异性[8]。本研究对开封地区奶牛进行隐孢子虫感染调查，鉴定隐孢子虫种类，并对微小隐孢子虫(C.parvum)进行亚型分析。

1 材料与方法

1.1 样本 2012年11月-2014年3月对开封地区4个奶牛养殖场和5个奶牛养殖小区随机经直肠采集622头奶牛新鲜粪便样本，外观均无明显异常，每份10～30 g，装入洁净自封袋中，记录信息，带回实验室，置4 ℃保存，48 h内检测。

1.2 检查方法 取5 g样本，加30 mL自来水搅拌混匀，经40目不锈钢粪筛过滤至50 mL离心管内；3 000 r/min离心3 min；弃上清，保留沉淀物；于沉淀物中加30 mL饱和蔗糖漂溶液，充分搅匀，3 000 r/min离心5 min；用铁丝吊环蘸取表层漂浮液置载玻片上，加盖玻片，400倍光镜检查。每片观察200个视野，发现卵囊者即判定为阳性。

1.3 样本DNA提取 取镜检为隐孢子虫阳性的200 mg粪便样本，用美国 OMEGA Bio-Tek生产的粪便DNA提取(Stool DNA Kit)试剂盒(D4015-02)按说明书步骤操作，提取的DNA置-20 ℃保存。

1.4 PCR和PCR-RFLP 18S rRNA和gp60引物及其反应程序分别参照Xiao等[9]和Alves等[10]的方法，引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。反应体系中加入模板DNA 1 μL，25 μmol/L上下游引物各0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2.5 μL，Mg2+1.5 μL，KOD-plus酶0.5 μL(日本TOYOBO公司生产)，加灭菌双蒸水至25 μL，第2次PCR的模板为第1次PCR的1 μL产物。取5 μL PCR产物，与1 μL 10×Loading Buffer混合均匀，加入1%琼脂糖凝胶加样孔，每排第一孔加5 μL DNA Marker DL2000作对照，电泳结束后在电泳凝胶成像系统仪中观察拍照。

参照Xiao等[11]和Feng等[6]的方法采用限制性内切酶SspI、MboII对18s rRNA基因扩增产物进行酶切，2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，根据酶切图谱鉴定隐孢子虫虫种。

1.5 测序 PCR产物测序委托北京诺赛基因有限公司完成，采用双脱氧终止法进行双向测序，测序仪为ABI PRISMTM3730 XL DNA Analyzer (Applied Biosystems，USA)。在GenBank上用Blast进行同源序列搜索，应用Clustal X 1.83进行比对分析。

1.6 统计学分析 采用χ2检验。

2 结 果

2.1 奶牛隐孢子虫感染情况 粪便样本中隐孢子虫阳性率为8.4%(52/622)，不同调查点奶牛隐孢子虫感染率具统计学意义(P<0.01)。5个养殖小区中有3个为隐孢子虫阳性，感染率分别为4.5%(2/44)、9.4%(3/32)和1.4%(1/69)，不同养殖小区奶牛隐孢子虫感染率具统计学意义(P<0.01)；4个养殖场均为隐孢子虫阳性，养殖场1、2、3、4奶牛隐孢子虫感染率分别为17.7%(14/79)、6.9%(10/145)、14.3%(12/84)和10.4%(10/96)，具统计学意义(P<0.05)。<30 d、31～60 d、61～120 d、121～180 d、181～360 d和>360 d奶牛隐孢子虫感染率分别为13.9%(5/36)、9.5%(7/74)、13.8%(15/109)、7.1%(7/98)、9.0%(13/144)和3.1%(5/161)，不同年龄段奶牛隐孢子虫感染率具统计学意义(P<0.01)；规模化养殖条件下奶牛隐孢子虫感染率为11.4%(46/404)，显著高于散养条件下2.8%(6/218)，不同养殖条件下奶牛隐孢子虫感染率具统计学意义(P<0.01)。

2.2 PCR和PCR-RFLP结果 基于18S rRNA基因位点，52份阳性样品中有50份成功扩增出830bp目的片段。经SspI和MboII酶切鉴定为安氏隐孢子虫的有23份，微小隐孢子虫、牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫分别为5份、12份和6份，混合感染的有4份，均为牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫混合感染。见图1。

M. 100 bp DNA相对分子质量标准； 1-5：牛隐孢子虫、牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫、芮氏隐孢子虫、安氏隐孢子虫、微小隐孢子虫的SspI酶切结果； 6-10：牛隐孢子虫、牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫、芮氏隐孢子虫、安氏隐孢子虫、微小隐孢子虫的MboII酶切结果

M: 100 bp DNA marker; 1-5:C.bovis,C.bovis+C.ryanae,C.ryanae,C.andersoni, andC.parvumdigested bySspI enzyme; 6-10:C.bovis,C.bovis+C.ryanae,C.ryanae,C.andersoni, andC.parvumdigested byMboII enzyme.

图1 18S rRNA基因PCR产物的限制性片段长度多态性分析结果

Fig.1 Results of PCR products of 18S rRNA gene digested by RFLP

2.3 不同养殖模式下奶牛隐孢子虫种类分布 散养条件下的6个隐孢子虫分离株成功扩增并进行RFLP， 2份为安氏隐孢子虫，4份为牛隐孢子虫。规模化饲养条件下的46个隐孢子虫分离株有44份成功扩增并进行RFLP，安氏隐孢子虫、微小隐孢子虫、牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫分别为21份、5份、8份和6份，4份牛隐孢子虫/芮氏隐孢子虫混合感染；4个养殖场中有3个发现有隐孢子虫混合感染，仅在规模化4场发现微小隐孢子虫感染。

2.4 不同年龄段奶牛隐孢子虫种类分布 <30 d奶牛中发现5份微小隐孢子虫感染；牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫主要感染31～180 d奶牛，分别为12份和6份，其余年龄段未见感染；23份安氏隐孢子虫发现于>61 d奶牛，>180 d奶牛仅发现有安氏隐孢子虫感染。31～60 d、61～120 d和121～180 d 奶牛的牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫混合感染分别为2份、1份和1份。

2.5 微小隐孢子虫基因亚型序列分析 基于gp60基因位点对5份微小隐孢子虫的PCR产物进行测序，所得序列在GenBank用Blast进行同源序列搜索，应用Clustal X 1.83 比对，结果显示5条序列与人兽共患基因亚型IIdA19G1(HQ009809和DQ280496)序列同源性为100%，鉴定5个微小隐孢子虫分离株为IIdA19G1亚型。

3 讨 论

调查发现开封地区5个养殖小区中有3个为隐孢子虫阳性场，4个奶牛养殖场中均为隐孢子虫阳性场，表明该地区奶牛隐孢子虫流行较为普遍，总感染率为8.4%，低于卢庆斌等[12]报道的河南省12月龄以内奶牛隐孢子虫感染率(26.12%)，高于安徽省和黑龙江省奶牛隐孢子虫的感染率(5.18%和5.3%)[13-14]。国内早期有关牛隐孢子虫的调查和鉴定多采用传统的形态学方法，对虫种鉴定区分能力有限。梁楠等[15]采用SspI和VspI酶切鉴定自牛分离的大型卵囊均为安氏隐孢子虫，与形态学观察鉴定相一致。林洁等[16]采用SspI和MboII酶切鉴定渝西地区奶牛有3种隐孢子虫，安氏隐孢子虫、牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫，以安氏隐孢子虫为优势虫种；Wang 等[17]采用SspI和MboII酶切鉴定出河南省规模化奶牛场断奶前犊牛感染4种隐孢子虫，以微小隐孢子虫和牛隐孢子虫为优势虫种，并发现微小隐孢子虫/牛隐孢子虫、微小隐孢子虫/芮氏隐孢子虫、牛隐孢子虫/芮氏隐孢子虫、安氏隐孢子虫/微小隐孢子虫混合感染。本研究采用SspI和MboⅡ酶切鉴定隐孢子虫，发现安氏隐孢子虫为优势虫种，并发现牛隐孢子虫/芮氏隐孢子虫混合感染，与上述报告一致。

分析显示，牛隐孢子虫感染率随年龄增长而下降，微小隐孢子虫主要感染断奶前犊牛，牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫主要感染幼龄牛和青年牛，而安氏隐孢子虫常见于青年牛和成年牛[1,6,17-19]。Feng等[6]研究发现微小隐孢子虫存在地方性流行，其鉴定上海5个断奶前犊牛隐孢子虫分离株4个为牛隐孢子虫，1个为芮氏隐孢子虫，1个断奶后分离株为牛隐孢子虫；而Liu等[14]报道黑龙江省低于2月龄犊牛未发现隐孢子虫感染，27个断奶后犊牛和成年奶牛隐孢子虫分离株，26个为安氏隐孢子虫，一个为芮氏隐孢子虫，进一步证实微小隐孢子虫存在地方性流行。本次调查不同年龄段奶牛隐孢子虫感染率具统计学意义(P<0.01)，随奶牛年龄增长隐孢子虫感染率呈下降趋势，与Wang 等[19]调查发现河南省断奶后奶牛隐孢子虫感染情况相符；不同年龄段奶牛隐孢子虫虫种分布也存在显著差异，犊牛感染以微小隐孢子虫、牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫为主，而青年牛和成年牛以安氏隐孢子虫为主，与Wang 等[17,19]报道均相一致。

牛隐孢子虫感染与多种因素相关，如品种、环境、饲喂方式、管理因素、卫生状况及季节，均可影响隐孢子虫的传播流行。发达国家牛隐孢子虫感染和发展中国家存在差异，其幼龄牛感染虫种也存在较大差异，研究认为与其饲养规模、牛舍分布和集约化饲喂程度密切相关，日本、印度、马来西亚、澳大利亚和加拿大等国报道的放牧牛隐孢子虫感染率低于规模化养殖场的奶牛[20,21]。本研究发现散养和规模化养殖条件下，奶牛肠道寄生虫感染率具统计学意义 (P<0.01)，提示规模化养殖更易群体感染隐孢子虫。

寄生于牛的4种隐孢子虫中，微小隐孢子虫是最常见的3种人兽共患虫种之一[1]。国内奶牛养殖量大，地域分布广，隐孢子虫病特别是分子流行病学尚研究较少，对牛源微小隐孢子虫人兽共患风险评估研究工作也开展较少。本研究通过分子生物学鉴定5个微小隐孢子虫分离株均与先前河南省奶牛流行的人兽共患基因亚型IIdA19G1一致，为评估隐孢子虫风险提供了依据，进一步表明奶牛源隐孢子虫对人类构成潜在威胁，同时为我国奶牛源隐孢子虫分子流行病学研究提供了基础资料。

[1]Xiao L. Molecular epidemiology of cryptosporidiosis: An update[J]. Exp Parasitol, 2010, 124(1): 80-89. DOI:10.1016/j.exppara.2009.03.018

[2]Kvac M, Hofmannova L, Hlaskova L, et al.Cryptosporidiumerinacein. sp. (Apicomplexa: Cryptospo- ridiidae) in hedgehogs[J]. Vet Parasitol, 2014, 201(1-2): 9-17. DOI:10.1016/j.vetpar.2014.01.014

[3]Widmer G, Lee Y, Hunt P, et al. Comparative genome analysis of twoCryptosporidiumparvumisolates with different host range[J]. Infect Genet Evol, 2012, 12(6): 1213-1221. DOI:10.1016/j.meegid.2012.03.027

[4]Xiao L, Feng Y. Zoonotic cryptosporidiosis[J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2008, 52(3): 309-323. DOI:10.1111/j.1574-695X.2008.00377.x

[5]Ralston B, Thompson RC, Pethick D, et al.Cryptosporidiumandersoniin Western Australian feedlot cattle[J]. Aust Vet J, 2010, 88: 458-460.

[6]Feng Y, Ortega Y, He G, et al. Wide geographic distribution ofCryptosporidiumbovisand the deer-like genotype in bovines[J]. Vet Parasitol, 2007, 144(1-2): 1-9.

[7]Widmer G, Sullivan S. Genomics and population biology ofCryptosporidiumspecies[J]. Parasite Immunol, 2012, 34(2-3): 61-71. DOI:10.1111/j.1365-3024.2011.01301.x.

[8]Waldron LS, Ferrari BC, Power ML. Glycoprotein 60 diversity inC.hominisandC.parvumcausing human cryptosporidiosis in NSW Australia[J]. Exp Parasitol, 2009, 122(2): 124-127. DOI:10.1016/j.exppara.2009.02.006.

[9]Xiao L, Escalante H, Yang CF, et al. Phylogenetic analysis ofCryptosporidiumparasites based on the small-subunit rRNA gene locus[J]. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(4): 1578-1583.

[10]Alves M,Xiao L, Sulaiman I, et al. Subgenotype analysis ofCryptosporidiumisolates from humans,cattle and zoo ruminants in Portugal[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(6): 2744-2747.

[11]Xiao L, Bern C, Limor J, et al. Identification of 5 types ofCryptosporidiumparasites in children in Lima, Peru[J]. J Infect Dis, 2001, 183(3): 492-497.

[12]Lu QB, Qiu SX, Ru BR, et al. Epidemiological investigation of cryptosporidiosis in dairy calves in some prefectures of Henan Province[J]. Chin Vet Sci, 2008, 38(3): 261-267. (in Chinese) 卢庆斌, 仇书兴, 茹宝瑞,等.河南省部分地区乳牛隐孢子虫病的流行病学调查[J].中国兽医科学, 2008, 38(3):261-267.

[13]Xu WL, Li PY, Gu YF, et al. Epidemiological survey of cow cryptosporidiosis in Anhui Province[J]. J Anhui Sci Technol Univ, 2007, 21(6): 9-11. (in Chinese) 徐文龙, 李培英, 顾有方, 等.安徽省奶牛隐孢子虫病流行病学调查[J]. 安徽科技学院学报, 2007, 21(6):9-11.

[14]Liu A, Wang R, Li Y, et al. Prevalence and distribution ofCryptosporidiumspp. in dairy cattle in Heilongjiang Province, China[J]. Parasitol Res, 2009, 105(3): 797-802. DOI:10.1007/s00436-009-1457-2

[15]Liang N, Jian FC, Li JC, et al. Species identification of cryptosporidia isolated from dairy cattle by PCR-RFLP and phylogenetic analysis[J]. Chin Vet Sci, 2009, 39(1): 22-28. (in Chinese) 梁楠, 菅复春, 李家诚, 等.乳牛源隐孢子虫种类的PCR-RFLP和分子种系发育分析鉴定[J]. 中国兽医科学, 2009, 39(1):22-28.

[16]Lin J, Zhou RQ, Tan YC, et al. Isolation and genotype identification ofCryptosporidiumspp.in dairy calves in Western Chongqing[J]. Acta Veterinaria Et Zootechnica Sinica, 2013, 44(3): 495-500. (in Chinese) 林洁, 周荣琼, 谭燕财, 等. 渝西地区奶牛隐孢子虫的分离和基因型鉴定[J].畜牧兽医学报, 2013, 44(3): 495-500.

[17]Wang R, Wang H, Sun Y, et al. Characteristics ofCryptosporidiumtransmission in preweaned dairy cattle in henan, China[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(3): 1077-1082. DOI:10.1128/JCM.02194-10

[18]Langkjaer RB, Vigre H, Enemark HL, et al. Molecular and phylogenetic characterization ofCryptosporidiumandGiardiafrom pigs and cattle in Denmark[J]. Parasitology, 2007, 134(Pt 3): 339-350.

[19]Wang R, Ma G, Zhao J, et al.Cryptosporidiumandersoniis the predominant species in post-weaned and adult dairy cattle in China[J]. Parasitol Int, 2011, 60(1): 1-4. DOI:10.1016/j.parint.2010.09.002

[20]Muhid A, Robertson I, Ng J, et al. Prevalence of and management factors contributing toCryptosporidiumsp. infection in pre-weaned and postweaned calves in Johor, Malaysia[J]. Exp Parasitol, 2011, 127(2): 534-538. DOI:10.1016/j.exppara.2010.10.015

[21]Amer S, Zidan S, Adamu H, et al. Prevalence and characterization ofCryptosporidiumspp. in dairy cattle in Nile River delta provinces, Egypt[J]. Exp Parasitol, 2013, 135(3): 518-523. DOI:10.1016/j.exppara.2013.09.002

Species and genotype identification ofCryptosporidiumin dairy cattle in Kaifeng, China

ZHAO Jin-feng1,2,QI Meng2,WANG Hai-yan3,HUA Jun3,ZHANG Na2,

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgricultureUniversity,Beijing100193,China;2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China;3.DepartmentofAnimalScience,HenanVocationalCollegeofAgriculture,Zhongmu451450,China)

To identifyCryptosporidiumspecies and subtype in dairy cattle in Kaifeng, China, fresh fecal samples were detected by using the Sheather’s sugar flotation method, and theCryptosporidium-positive samples were identified with a restriction fragment length polymorphism analysis of the small subunit ribosomal RNA.C.parvumwas subtyped by using 60 kDa glycoprotein (gp60) gene. The infection rates ofCryptosporidiumspp. was 8.4% (52/622). Significant differences were observed between the infection rate of sampling sites, age and feeding condition (P<0.01). In the 18S rRNA gene, 50 isolates were successfully amplified, and the PCR product was digested with restriction enzymesSspI andMboII, respectively. The result showed thatC.andersoniwas the dominant species (n=23), as well as other species ofCryptosporidiumwereC.parvum(n=5),C.bovis(n=12) andC.ryanae(n=6), and the occurrence of infections with mixedC.bovisandC.ryanae(n=4). Sequence analyses ofgp60 gene revealed that five isolates were zoonotic subtype IIdA19G1. Dairy cattle infected zoonoticC.parvumsubtype in Kaifeng, which is of capability of potential transmission between human and animal.

Cryptosporidium; genotype; identification; dairy cattle

Liu Qun, Email: qunliu@cau.edu.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.010

河南省高校科研创新团队(No.012IRTSTHN005)和国家自然科学基金重点项目(No.31330079)

刘群, Email: qunliu@cau.edu.cn

1.中国农业大学动物医学院， 北京 100193； 2.河南农业大学牧医工程学院， 郑州 450002； 3.河南农业职业学院动物科学系，中牟 451450

Supported by the Program for Science and Technology Innovative Research Team at the University of Henan Province (No. 012IRTSTHN005), and the State Key Program of the National Natural Science Foundation of China (No. 31330079)

R382

A

1002-2694(2015)08-0733-04

2014-10-19；

2015-02-11