阿司匹林与硼替佐米在多发性骨髓瘤细胞中相互作用的实验探讨

丁江华，袁利亚，陈国安



·论著·

阿司匹林与硼替佐米在多发性骨髓瘤细胞中相互作用的实验探讨

丁江华，袁利亚，陈国安

目的 探讨阿司匹林(ASA)联合硼替佐米(BTZ)在多发性骨髓瘤(MM)细胞中的相互作用及分子机制。方法 以MM1.S与RPMI-8226细胞为研究对象，观察ASA、BTZ及ASA联合BTZ对MM细胞增殖与凋亡的影响，分析二者相互作用，并检测对Bcl-2、总Akt蛋白与磷酸化蛋白表达的影响。结果 在24～72 h内，ASA组和BTZ组的细胞增殖抑制率均低于ASA+BTZ组(P<0.05)，药物相互作用分析显示：二者存在相加作用；在药物处理48 h后，ASA组和BTZ组细胞凋亡率均低于ASA+BTZ组(P<0.05)；药物干预48 h后，ASA和BTZ组均下调Bcl-2蛋白表达，ASA+BTZ组则显著抑制Bcl-2蛋白水平(P<0.01，P<0.05)；药物干预48 h后，ASA组抑制p-Akt(Thr308)与 p-Akt(Ser473)蛋白表达(P<0.05)，BTZ组上调p-Akt(Thr308)蛋白表达水平(P<0.05)，而ASA+BTZ组则明显抑制p-Akt(Thr308)与 p-Akt(Ser473)蛋白表达(P<0.05)，但对总Akt水平无影响(P>0.05)。结论 ASA具有增强BTZ的抗MM作用，其机制可能为通过下调Bcl-2表达与抑制BTZ诱导的Akt磷酸化。

多发性骨髓瘤；阿司匹林；硼替佐米；药物相互作用

近10年来，由于新药特别是硼替佐米(bortezomib, BTZ)的应用，多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)的临床疗效得到了极大的改善。BTZ作为核心药物，被推荐用于MM的诱导、巩固、补救或维持治疗[1]。然而，BTZ同样存在原发与继发性耐药问题[2]。因此，研究如何克服BTZ耐药，增强BTZ对MM细胞抗肿瘤作用，成为亟待解决的重要课题。我们在前期研究中已证实：阿司匹林(aspirin, ASA)在MM中具有抗肿瘤效应[3]。在本研究中，我们对ASA与BTZ在MM中的相互作用和ASA对BTZ在MM中的化疗增敏作用及机制进行分析。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 RPMI-1640培养基、青链霉素混合液(双抗)、胎牛血清(FBS)等购自美国Gibco公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自日本同仁化学研究所，Annexin V-FITC 凋亡试剂购自美国BD Biosciences公司。磷酸化蛋白提取试验购自德国Merck Millipore公司。Anti-GADPH抗体购自杭州贤至生物公司，Anti-Bcl-2抗体购自美国Sigma-Aldrich公司。p-Akt(Thr308)、p-Akt(Ser473)、总Akt抗体购自美国Cell Singaling Technology公司，二抗(羊抗兔)购自美国EarthOx公司。

1.2 实验药物 阿司匹林粉末购自美国Sigma-Aldrich公司，以10 mol/L NaOH溶解，调整pH=7.0[4]。再以PBS稀释到50 mmol/L作为储存母液，用0.22 μm滤膜过滤除菌后分装保存于4℃。

硼替佐米粉末购自美国Selleckchem公司。在5 mg硼替佐米安瓿中加入400 μl二甲基亚砜，轻轻混匀至完全溶解，再加入PBS 4600 μl，即配制成终体积5 ml的溶液，以0.22 μm滤膜过滤除菌，浓度为260 μmol/L(即1 mg/ml)，再以PBS稀释至50 nmol/L作为储存母液，-20℃避光保存。

1.3 细胞培养 MM1.S细胞株由中国医学科学院血液病医院邱录贵教授惠赠；骨髓地塞米松耐药(RMPI-8226)细胞株由浙江大学附属第二医院血液科赵小英教授惠赠。MM1.S与RPMI-8226细胞常规培养于含10%FBS、青霉素与链霉素组成的完全RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养，每3～4 d传代1次。所有实验均取对数生长期细胞。

1.4 实验分组 由于慢性炎症疾病患者服用常规ASA后，其体内血清ASA浓度为1～3 mmol/L[5]。我们的前述实验显示：2.5 mmol/L ASA在48 h内对MM1.S与RPMI-8226细胞的增殖抑制率约为50%[3]。因此，选择2.5 mmol/L ASA作为药物联合的实验浓度。由于标准剂量(1.3 mg/m2)硼替佐米在人体内的血药浓度可在333 nmol/L高峰持续1 h，随后进入10 nmol/L持续47 h的平台期[6]。因此，我们选择10 nmol/L作为BTZ药物联合的实验浓度。根据所加的药物不同，分成4组：对照组、ASA组、BTZ组、ASA+BTZ组，对照组不给予任何药物。

1.5 实验方法

1.5.1 CCK-8法检测细胞增殖：收集细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml。取1×104个接种于96孔板中，分别加入上述各组药物，终体积为200 μl/孔，另设仅加RPMI-1640培养液(200 μl/孔)的空白孔作为空白组，置于37℃培养箱分别孵育24 h、48 h与72 h。在预设时间到达时，向各孔加20 μl CCK-8溶液，继续孵育4 h，酶标仪检测OD450值。细胞增殖率(Survival)=(药物作用组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%，增殖抑制率=1-survival。

根据参考文献[7]，两药物相互作用分析方法如下：R=survival(ASA+BTZ)/[survival(ASA)×survival(BTZ)]。R<0.8，表示二者具有协同作用；0.81.2表示二者具有拮抗作用。

1.5.2 Annexin V-FITC检测细胞凋亡率：收集处理48 h后的各组细胞，用PBS洗涤2次，用1×Annexin V结合缓冲液重悬细胞，调整浓度为1×106个/ml。取各组细胞(1×105)加入待测管中，分别加入5 μl AnnexinV-FITC 及5 μl PI染液，轻微吹打重悬，避光孵育15 min，再加400 μl 1×Annexin V结合缓冲液，1 h内流式细胞仪检测。

1.5.3 蛋白质印迹(Western blot)检测p-Akt、总Akt与Bcl-2的蛋白表达:首先提取处理48 h后的各组细胞的总蛋白与磷酸化蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转移到硝基纤维素滤膜上，脱脂奶粉封闭1 h，分别加入兔抗人单克隆抗体GADPH(1：1000)、Bcl-2(1：500)、p-Akt(Thr308)(1：1000)、p-Akt(Ser473)(1：1000)与总Akt(1：1000)，4℃孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1：10 000)，放入ChemiDocTM XRS+System(Bio-Rad)中进行显影并摄像。以GADPH作为内参照，利用Gel-Pro Aanalyzer软件计算目的蛋白的积分光密度值(IOD)。

2 结果

2.1 细胞增殖活性测定 在MM1.S细胞或RPMI-8226细胞中，在24～72 h内3组中两种细胞的增殖抑制率作用呈时间依赖性，ASA组和BTZ组的细胞增殖抑制率均低于ASA+BTZ组(P<0.05)，见表1、2。药物相互作用分析显示：R值均为0.8～1.2之间，提示二者存在相加作用，即ASA具有增强BTZ抗骨髓瘤细胞增殖的作用。

表1 3组MM1.S细胞的增殖抑制率比较

注：ASA为阿司匹林，BTZ为硼替佐米；与ASA+BTZ组比较，aP<0.05

表2 3组PMI-8226细胞的增殖抑制率比较

注：ASA为阿司匹林；BTZ为硼替佐米；与ASA+BTZ组比较，aP<0.05

2.2 细胞凋亡测定 在药物处理48 h后的MM1.S细胞中，ASA组、BTZ组、ASA+BTZ组和对照组的MM细胞凋亡率分别为(45.21±2.53)%、(45.37±2.16)%、(64.27±2.93)%、(1.90±0.16)%，在RPMI-8226细胞中MM细胞凋亡率分别为(37.89±2.19)%、(57.97±2.65)%、(77.20±2.05)%、(2.58±0.59)%。在MM1.S细胞和RPMI-8226细胞中，ASA组和BTZ组细胞凋亡率均低于ASA+BTZ组(P<0.05),ASA组、BTZ组和ASA+BTZ组细胞凋亡率均明显高于对照组(P<0.01)。

2.3 B细胞白血病/淋巴瘤(Bcl)-2蛋白、p-Akt与总Akt蛋白表达 在MM1.S或RPMI-8226细胞中，药物干预48 h后ASA、BTZ、ASA+BTZ组Bcl-2、p-Akt(Ser473)蛋白表达水平均低于对照组(P<0.05，P<0.01)。与对照组比较，ASA、ASA+BTZ组p-Akt(Thr308)蛋白表达水平降低(P<0.01)，BTZ组p-Akt(Thr308)蛋白表达水平升高(P<0.05)，ASA组、BTZ组、ASA+BTZ组间p-Akt(Thr308)、p-Akt(Ser473)蛋白表达水平差异有统计学意义(P<0.01)，见图1、2，4组间总Akt蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 4组MM骨髓瘤细胞Bcl-2、p-Akt与总Akt表达水平比较

注：ASA为阿司匹林；BTZ为硼替佐米；Bcl-2蛋白为B细胞白血病/淋巴瘤(Bcl)-2蛋白；与对照组比较，aP<0.05；bP<0.01；与ASA组比较，dP<0.01；与BTZ组比较，fP<0.01

3 讨论

人口老龄化的加剧导致MM发病率逐年上升，在血液肿瘤中居第2位。最新流行病学数据显示，MM 5年生存率已提高到45%[8-15]。其中，作为首个蛋白酶体抑制剂，BTZ在MM治疗中的地位极为重要，目前已被美国国立综合癌症网络(NCCN)与中国版NCCN指南推荐用于MM的一线、二线及维持治疗[1]。然而，BTZ也无法根治MM，主要归因于BTZ也存在耐药现象[2]。尽管不断有临床试验探讨增强BTZ的抗MM作用，可惜的是均为Ⅰ/Ⅱ期临床试验[16-17]，距临床应用尚需更多的临床试验来验证。ASA作为血栓预防药物，常规用于MM的预防性抗凝治疗[18]。近年来发现ASA在结肠癌、胰腺癌、乳腺癌等实体肿瘤中具有抗癌作用[19]。我们在前期研究中已证实ASA具有抗MM作用[3]。由此可见，ASA在MM中具有抗凝与抗肿瘤的“双重作用”。然而，ASA与BTZ联合在MM中的相互作用如何，目前尚不清楚。

图1 MM1.S和RPMI-8226细胞不同药物处理48 h后Bcl-2蛋白表达

ASA为阿司匹林；BTZ为硼替佐米；GADPH为内参照；Bcl-2蛋白为B细胞白血病/淋巴瘤(Bcl)-2蛋白

图2 MM1.S和RPMI-8226细胞不同药物处理48 h后Akt蛋白表达

ASA为阿司匹林；BTZ为硼替佐米；GADPH为内参照

本研究发现，与ASA和BTZ组比较，ASA+BTZ组对MM细胞具有更高的增殖抑制与凋亡诱导作用。而且药物相互作用分析显示：二者在抑制MM细胞增殖中呈相加作用，表明ASA对BTZ抗MM效应具有化疗增敏作用。由于ASA作为血栓预防药物应用于临床有50余年，本实验结果为ASA联合BTZ治疗MM提供实验依据。

研究证实，MM细胞在骨髓中积聚与细胞凋亡受抑制密切有关[20]。因此，诱导MM细胞凋亡是MM主要治疗策略之一[21]。其中，Bcl-2介导的细胞凋亡机制在MM发病中起重要作用，而且Bcl-2过表达还与地塞米松(Dex)与阿霉素(ADM)的耐药发生密切相关[22-23]。本实验发现，ASA+BTZ组MM细胞Bcl-2蛋白表达低于ASA和BTZ组。特别是对于Dex耐药MM细胞系(RPMI-8226)，ASA组可下调Bcl-2水平，与BTZ联合时更明显抑制Bcl-2表达。该结果提示，对于Bcl-2过表达所介导的Dex与ADM耐药性MM而言，应用ASA治疗有助于克服Dex与ADM耐药，提高二者的临床疗效。

既往研究证实，磷酸激酶B(PKB，Akt)通路异常活化在MM发病与耐药中起重要作用，且与疾病分期正相关，其中Thr308与Ser473的磷酸化是Akt通路活化的关键步骤，提示Akt可作为MM治疗靶点[24-26]。本实验结果显示：在MM1.S与PRMI-8226细胞中均检测到Akt蛋白Thr308与Ser473磷酸化。与对照组相比，ASA组可抑制MM细胞Akt-Thr308与Akt-Ser473磷酸化。由于Bcl-2高表达与Akt蛋白磷酸化均与Dex耐药相关[21, 26]，ASA恰可同时抑制RPMI-8226细胞Bcl-2水平与Akt磷酸化，进一步提供了ASA治疗Dex耐药性MM的理论依据。

研究发现：部分靶向药物如表皮细胞生长因子(EGFR)抗体(昔妥西单抗)等在持续应用中还可引起某些蛋白分子的改变，继耐导致继发性耐药，称为“分子学副作用”[27]。实验显示：在MM细胞中，BTZ以时间依赖性诱导Akt蛋白磷酸化，继而导致细胞对BTZ敏感性降低；抑制Akt蛋白磷酸化，一定程度上可恢复骨髓瘤细胞对BTZ药物敏感性，表明Akt蛋白磷酸化介导BTZ继发性耐药发生[28]。本实验显示：ASA单药可抑制MM细胞Akt-Thr308与Akt-Ser473磷酸化；BTZ单药可诱导MM细胞的Akt-Thr308与Akt-Ser473磷酸化。相反的是，ASA与BTZ联合组则显著抑制MM细胞的Akt磷酸化，特别是Akt-Thr308几乎完全受抑制。提示ASA可通过抑制Akt磷酸化对BTZ起化疗增敏作用。

新近的一项Ⅱ期临床试验提示：对于BTZ治疗曾获PR以上疗效后出现进展，或6个月以上复发的MM患者，再次应用BTZ治疗仍然可获40%有效率，但有30.7%的患者发生外周神经炎[29]。本实验发现ASA与BTZ在MM细胞中具有相加作用，其机制为ASA增强BTZ下调Bcl-2表达与抑制BTZ诱导的Akt磷酸化。因此，ASA联合BTZ治疗MM，尤其是BTZ复发性MM患者具有潜在的应用前景。

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A Study on Interaction of Aspirin and Bortezomib in Multiple Myeloma Cells

DING Jiang-hua1, YUAN Li-ya2, CHEN Guo-an3

(1. Department of Hematology and Oncology, 171 Hospital of the PLA, Jiujiang, Jiangxi 332000, China; 2. Hematology Institution, Academy of Medical Science of Jiangxi Province, Nanchang 330006, China; 3. Department of Hematology, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China)

Objective To explore the interaction and its molecular mechanisms of Aspirin (ASA) and Bortezomib (BTZ) in multiple myeloma (MM) cells. Methods The MM1.S and RPMI-8226 cells were used in this study, and the effects of ASA, BTZ and ASA in combination of BTZ on cell proliferation and apoptosis in MM cells were observed. The interaction between ASA and BTZ was analyzed, and the effects on levels of Bcl-2 and total Akt protein and phosphorylated protein expression were detected. Results The inhibitory rates of cell proliferation treated within 24-72h in ASA and BTZ groups were lower than that in ASA and BTZ group (P<0.05), and drug interactions analysis showed that the additive effect existed between ASA and BTZ; after treatment for 48 h, apoptotic rates in ASA and BTZ groups were lower than that in ASA and BTZ group (P<0.05); after treatment for 48 h, Bcl-2 protein levels in MM cells were reduced in ASA and BTZ groups, while Bcl-2 protein level in ASA and BTZ group was significantly inhibited (P<0.01,P<0.05); expressions of p-Akt (Thr308) and p-Akt (Ser473) were inhibited only by ASA treatment (P<0.05), but the p-Akt (Ser473) expression was increased only by BTZ treatment in MM cells (P<0.05), while the expressions were significantly inhibited by ASA and BTZ treatments (P<0.05), but there was no effect on the total Akt level (P>0.05). Conclusion ASA may enhance the effect of BTZ against MM cells possibly through reducing Bcl-2 expression and inhibiting AKT phosphorylation induced by BTZ.

Multiple myeloma; Aspirin; Bortezomib; Drug interactions

国际合作专项基金(2011DFA32820);国家自然科学基金(81460037)

332000 江西 九江,解放军171医院血液肿瘤科(丁江华)；330006 南昌，江西省医学科学研究院血液研究所(袁利亚)；330006 南昌，南昌大学第一附属医院血液科(陈国安)

陈国安，E-mail:gachen923@hotmail.com

R969

A

2095-140X(2015)03-0050-05

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.03.012

2015-01-18 修回时间：2015-02-20 )