不同途径输注DC-CIK联合TACE治疗进展期肝癌的临床研究

邱宝安，吴印涛，赵文超，夏念信，杨英祥，刘 鹏，祝建勇，安 阳，王敬晗



·论著·

不同途径输注DC-CIK联合TACE治疗进展期肝癌的临床研究

邱宝安，吴印涛，赵文超，夏念信，杨英祥，刘 鹏，祝建勇，安 阳，王敬晗

目的 探讨不同途径输注DC-CIK联合TACE对进展期肝细胞癌的治疗价值。方法 自2011年3月1日—2014年1月1日，选取收治入院的进展期肝细胞癌146例，随机分成3组。A组51例，单纯行TACE治疗；B组46例，行TACE治疗+外周静脉回输DC-CIK细胞治疗；C组49例，行TACE治疗+肝动脉回输DC-CIK细胞治疗。观察治疗后AFP、肝功能、肿瘤进展情况、T细胞亚群变化、毒副作用及病人生存率情况。结果 治疗后B组CD3+、CD4+和C组CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+均高于A组和本组治疗前(P<0.05)；B、C组间比较无显著差异(P>0.05)。A组和B组半年进展率、生存率比较无显著差异(P>0.05)；C组与其余两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 局部应用CIK联合TACE较全身应用CIK联合TACE是安全的方法，可提高治疗效果，延长患者生存期，具有一定的临床意义。

肝肿瘤；树突细胞；细胞因子诱导杀伤细胞；输注,动脉内;输注,静脉内

临床上，进展期肝细胞癌在肝癌占有着重要的比例，有报道指出高达70%～80%[1-2]，对于此类患者，已经失去手术机会，传统的介入治疗水平也已达到疗效瓶颈，很难有进一步提升的空间。近年研究表明，树突状细胞-细胞因子激活的杀伤细胞(DC-CIK)可明显地抑制肿瘤生长，并且DC-CIK可以抑制乙肝病毒复制，抑制病毒性肝炎的进展[3-5]。研究表明，DC-CIK治疗效果与其数量、细胞活性存在相关性[6]；因此，有必要观察肿瘤局部应用与全身应用疗效的差异，进一步探讨提高进展期肝癌疗效的可能性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 入选标准：选取2011年3月1日—2014年1月1日收治的不符合手术指征的进展期肝细胞癌患者，均经病理学、影像学或肿瘤标志物确诊；排除标准：Child-Pugh肝功能分级为C、肝外存在肿瘤转移者、碘制剂过敏难以治疗、患者及家属不同意入组者。共选取146例，男128例，女18例，年龄35～72岁(平均55.7岁)，所有入组患者采用抽签随机分为A、B、C组，3组间患者数量、性别、年龄、甲胎蛋白(AFP)值、肝功能分级、肿瘤大小、数量及有无门静脉癌栓等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。所有入组患者均已签署知情同意书，并经医院伦理委员会批准。

表1 3组患者一般资料比较

注：A组仅给予TACE治疗，B组给予外周静脉输注DC-CIK+TACE治疗，C组给予肝动脉输注DC-CIK+TACE治疗

1.2 治疗方法 B组在行肝动脉化疗栓塞术(transarterial chemoembolization， TACE)前一天抽血采集细胞进行培养扩增，TACE术后2周，待化疗药物洗脱后行外周静脉输注DC-CIK，分两天给予。C组同样在TACE前一天抽血采集细胞进行培养扩增，两周药物洗脱后行肝动脉造影，肿瘤区域供应的动脉内输注DC-CIK，另外一次隔日外周输注DC-CIK。A组仅行TACE，不行DC-CIK输注。

1.3 DC-CIK细胞的制备 所有入组患者均签署知情同意书，在行TACE治疗当天早晨空腹用真空采血管采集外周静脉血54 ml，然后在药品生产质量管理规范(GMP)实验室分离单个核细胞(peripheral blood mononuclearcells， PBMC)，用GT-T551无血清淋巴细胞培养液调整细胞浓度为1×106个/ml，在每毫升细胞悬液中加入α-干扰素(IFN-α)800 U/ml，加入10%的自体血浆，转入用5 μg/ml CD3单抗预先包被的培养瓶中，放置37℃，5%CO2培养箱中培养，第2天添加培养液并加入重组人白介素-2(rhIL-2)1000 U/ml，期间根据细胞生长情况补充GT-T551培养液、自体血浆和相应的rhIL-2，培养至第5天，根据细胞增殖情况调整细胞密度，并转入GTT610(A)透气培养袋进行扩大培养，每2～3天根据细胞的生长增殖情况，补充GT-T551淋巴细胞培养液、相应的rhIL-2和自体血浆。并采用台盼蓝拒染法计数，检测细胞表面标记CD3、CD4、CD8以鉴定DC-CIK细胞。并在培养的第5、10、12天分别取样行细菌和真菌培养，并于回输前取样行内毒素和支原体检测，所有结果均为阴性才能收获细胞并计数，台盼蓝染色法检测细胞活力，每次回输的细胞数量>2×109个，共回输细胞数量>1×1010个，细胞活率>95%。收获细胞经洗涤配成200 ml细胞悬液，加入5%的人血白蛋白和20万单位白细胞介素-2，混匀后送病房立即给患者回输。以上操作除采血外，其余均在我院生物医学治疗中心进行[6]。

1.4 TACE治疗 应用Seldinger技术，经股动脉穿刺置管，选择性插入肿瘤供应靶动脉，造影明确后进行化疗及栓塞。化疗方案为：替加氟1000 mg，表阿霉素20～30 mg，卡铂40 mg。栓塞剂选用碘化油，用量以肿瘤区域无明显血供为准，剂量范围20～60 ml。TACE合并DC-CIK全身或局部应用患者，在栓塞后2周药物洗脱后进行。

1.5 DC-CIK细胞的回输 采血后2周进行CIK细胞收获，立即无菌运送到病房给患者回输，共进行两次回输。B组两次均采用外周静脉回输，输注前常规静脉应用甲泼尼龙20 mg。C组第1次细胞回输采取经股动脉穿刺置管，经肝固有动脉回输的方法，第2次采取外周静脉回输的方法。B、C两组均当日回输DC-CIK细胞5×109个，隔日再次回输5×109个，回输细胞总数共计>10×109个。

1.6 观察指标 观察指标包括AFP、肝功能、肿瘤进展情况、T细胞亚群变化、毒副作用及患者生存率，术后每1个月复查1次肝脏CT或B超。DC-CIK细胞治疗前及治疗后2周，用流式细胞仪检测3组患者外周血T细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)。细胞回输过程中，观察患者有无过敏、休克等不良反应。

2 结果

2.1 T细胞亚群 治疗后B组CD3+、CD4+均高于A组和治疗前(P<0.05)，C组CD3+、CD4+、CD8+均高于A组和治疗前(P<0.05)，治疗后B组CD8+、CD4+/CD8+和C组CD4+/CD8+与A组及治疗前比较，差异无统计学意义(P>0.05)，治疗后B组和C组CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 3组患者治疗前后T细胞亚群变化比较

注：A组仅给予TACE治疗，B组给予外周静脉输注DC-CIK+TACE治疗，C组给予肝动脉输注DC-CIK+TACE治疗；与治疗前比较，aP<0.05；与A组治疗后比较，cP<0.05

2.2 AFP变化情况 患者行TACE术后均有一定程度的肝损害，表现为转氨酶的升高或合并轻度胆红素的改变，经保肝等对症处理后1周左右，肝功能基本恢复正常。AFP的变化：各组术前AFP升高的患者，TACE术后均有不同程度的降低，A组、B组和C组分别为35例、32例、33例，分别占68.6%、69.6%和67.3%，3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 毒副反应 在DC-CIK细胞输注的毒副作用方面，主要表现为术后一过性发热(8/95)，未见其他不良反应，对症处理后缓解。B组术后出现3例一过性发热，C组术后出现5例一过性发热，两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 肿瘤进展与患者生存情况 全部患者肿瘤进展均得到一定的控制，半年后仍有一定的患者出现肿瘤进展，表现为肿瘤体积增大、出现新的病灶及AFP的进一步升高。A组和B组的半年进展率各为37.3%(19/51)和39.1%(18/46),两组比较差异无统计学意义(P>0.05)；C组为18.4%(9/49)，与其余两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

在生存率方面，进展期肝癌患者半年生存率，A组与B组分别为70.6%(36/51)和73.9%(34/46)，两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示外周输注DC-CIK细胞可以改善T细胞亚群的功能，但对生存影响有限；C组为91.8%(45/49)，与其余两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，考虑局部沉积的DC-CIK细胞可能在控制肿瘤发展，改善早期患者生存中具有一定作用。3组患者1年生存率比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

3 讨论

肝癌为影响我国人民身体健康第二大疾病。由于我国乙型肝炎患者数量众多，大约有20%的乙型肝炎患者转化为乙肝肝硬化[7-8]。肝炎、肝硬化、肝癌被公认是肝癌三步曲。肝癌发病隐袭，进展迅速，患者就诊时往往已属中晚期，绝大多数已失去手术机会。TACE被普遍认为是不能手术切除肝癌的首选治疗方法[9]。但是，许多单纯TACE治疗的肝癌患者，即使多次重复治疗，肿瘤病灶内仍有癌细胞残存[10-11]。与此同时，TACE难以彻底杀灭肿瘤，对于大多数患者难以维持长期生存，其治疗方法已经达到峰值，难有进一步提升空间。

图1 3组进展期肝癌患者生存曲线

A组仅给予TACE治疗，B组给予外周静脉输注DC-CIK+TACE治疗，C组给予肝动脉输注DC-CIK+TACE治疗

DC-CIK作为近年来广泛应用的抗肿瘤治疗，研究表明，多种细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)细胞可直接杀伤肿瘤细胞，通过黏附因子LFA-1/ICAM-1途径与肿瘤细胞结合后,分泌含大量BLT酯酶的颗粒，这些颗粒能穿透靶细胞膜,导致肿瘤细胞的裂解[12]。同时，CIK细胞可通过释放多种细胞因子杀伤肿瘤细胞，这些肿瘤因子不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用,还可通过调节免疫系统间接杀伤瘤细胞。CIK细胞可以分泌大量的IFN-α。IFN-α是由CD4+或CD8+细胞产生的同源二聚体糖蛋白,可通过多种途径直接或间接发挥抗肿瘤作用,增强自然杀伤细胞(NK)、巨噬细胞(M5)以及细胞毒性T细胞(CTL)的活性；IFN-α还可以促进肿瘤细胞表达MHC-类分子,有助于肿瘤抗原的递呈和激活细胞毒性T淋巴细胞。CIK细胞诱导肿瘤细胞凋亡及坏死，能活化肿瘤细胞凋亡基因。[13-14]

与此同时，研究表明DC-CIK细胞溶瘤作用与其数量及功能密切相关[13-14]。回输细胞数量越多治疗效果越好，并要求于手术或放、化疗之后过继性细胞免疫治疗越早效果越好。回输的细胞组成以免疫效应细胞为主，要求FACS检测CD3+、CD56+细胞≥30%，CD3+、CD8+≥60%，细胞活力≥95%。单纯CIK的溶瘤率为15%，而共培养的DC-CIK的溶瘤率可达71%，并且分泌更多的γ-干扰素，增强TH1型细胞免疫功能[13-14]。临床上，过继性免疫细胞主要通过静脉途径回输。这些细胞进入人体以后首先到达肺脏，并于2～4 h达到高峰，随后分布到肝、肾、脾等部位，24 h趋于稳定[15]。类似于药物的首过效应，过继性免疫细胞最先到达的器官获得最大限度的截留[15]。肺癌治疗例数最多或是原因之一[16]。过继性免疫细胞对肿瘤组织是否具有偏嗜性尚有争议。理论上，灌注治疗能实现CIK细胞的肝脏聚集，因此治疗效果较好[17-23]。但由于肝动脉造影是有创治疗，会对患者造成伤害，治疗次数应有限制，因此选择前期DC-CIK细胞灌注冲击治疗一定疗程，患者病情稳定后予以CIK细胞静脉回输巩固治疗比较合理。本组临床观察发现，采取肝动脉直接将DC-CIK细胞回输入肝脏可以提升疗效，提高患者的生存质量。本研究显示，局部动脉应用DC-CIK细胞与外周静脉应用比较，虽然A、B组对血液T细胞亚群的影响并无明显差异，但肿瘤进展率及患者半年生存率有明显差异，体现局部应用可以提高CIK细胞效果。通过肝动脉局部应用DC-CIK细胞导致肿瘤进展时间延长的机制尚不清楚，这可能与局部DC-CIK细胞在肿瘤附近存留的数量存在一定关系。此外，临床可观察到B、C组少数患者(3/95)出现了非常令人振奋的现象，DC-CIK免疫细胞治疗使乙肝患者表面抗原转阴，使肝癌患者在病毒清除方面获益，但其具体机制尚不明确，这些治疗作用为治疗计划的制定提供了新的思路，这将是我们今后工作的重点。

综上所述，DC-CIK细胞联合TACE治疗是进展期肝癌治疗的一种有效方法，尤其是结合局部输注DC-CIK细胞，可以杀伤肿瘤细胞，同时减少乙肝病毒数量，值得进一步扩大样本量，进行更广泛和深入的研究。

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A Clinical Study of Different Approaches of DC-CIK Infusion Combined with TACE in Treatment of Aggressive-phase Hepatocellular Carcinoma

QIU Bao-an, WU Yin-tao, ZHAO Wen-chao, XIA Nian-xin, YANG Ying-xiang, LIU Peng, ZHU Jian-yong, AN Yang, WANG Jing-han

(Department of Genneral Surgery, General Hospital of the Chinese Navy, Beijing 100048, China)

Objective To explore therapeutic value of different approaches of DC-CIK (dendritic cell- cytokine-induced killer cells) infusion combined with TACE in treatment of aggressive-phase hepatocellular carcinoma. Methods A total of 146 inpatients with aggressive-phase hepatocellular carcinoma admitted during Mar 1, 2011 and Jan 1, 2014 were divided into group A (n=51)undergoing single TACE therapy, group B (n=46) undergoing TACE and peripheral vein return infusion of DC-CIK and group C (n=49) undergoing TACE and hepatic artery return infusion of DC-CIK. The conditions of AFP (alpha-fetoprotein), liver function, tumor progression, T-cell subset changes, toxic and side-effect and survival rate of patients after the therapy were observed. Results The levels of CD3 and CD4 in group B and levels of CD3, CD4, CD8 and CD4/CD8 after the therapy in group C were significantly higher than those in group A and those before the therapy in the same group (P<0.05); but the differences between group B and C were not statistically significant (P>0.05). The differences in progression and survival rates of six months between group A and B were not statistically significant (P>0.05); while the differences between group C and group A and B were statistically significant (P<0.05). Conclusion Local use of CIK-DC combined with TACE is safer than the total use of CIK-DC combined with TACE, and it can improve treatment effectiveness and increase life span of patients, which has certain clinical significance.

Liver neoplasms； Dendritic cells； Cytokine-induced killer cells; Infusions, intra-arterial; Infusions, intravenous

北京市科委“首都市民健康培育项目”(Z141100002114015)

100048 北京，海军总医院肝胆外科

邱宝安，Email：luckqiu@medmail.com

R735.7

A

2095-140X(2015)03-0058-05

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.03.014

2014-10-30 修回时间：2015-01-01)