过表达TROP2对细胞增殖及迁移能力的影响

崔 倪，李 明，倪劲松，宋 军

（1.吉林大学临床医学院，吉林长春130021；2.吉林大学第一医院二部病理科，吉林长春130041；3.吉林大学中日联谊医院电诊科，吉林长春130033）

过表达TROP2对细胞增殖及迁移能力的影响

崔 倪1，李 明2，倪劲松2，宋 军3＊

（1.吉林大学临床医学院，吉林长春130021；2.吉林大学第一医院二部病理科，吉林长春130041；3.吉林大学中日联谊医院电诊科，吉林长春130033）

目的 探讨过表达肿瘤相关钙信号转导因子2（TROP2）对细胞增殖及迁移的影响，为阐明肿瘤的发生机制提供新的途径。方法 构建TROP2真核表达载体pcDNA3－TROP2；采用脂质体法将pcDNA3－TROP2转染入人正常肝细胞LO2中，并通过G418压力筛选获得稳定表达TROP2的细胞株，之后通过MTT法检测细胞的活力，通过划痕法检测细胞的迁移能力。结果 成功获得了过表达TROP2的细胞株；进一步的研究结果显示，过表达TROP2可增强细胞的活力和迁移能力。结论 过表达TROP2可促进肿瘤的发生，此结果为阐明肿瘤发生机制及肿瘤治疗提供了新的途径。

TROP2；肿瘤发生；增殖；迁移

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0879）

肿瘤相关钙信号转导因子2（Tumor－associated calcium signal transducer2，TROP2）基因于1995年首次被克隆。该基因位于人类1号染色体短臂D1S2890和D1S2801之间一个长约2.6cm的区域上，cDNA全长972bp，编码一个含323个氨基酸、35.7kDa的跨膜糖蛋白。此蛋白带有四个潜在的从基因组序列中预测出的N连接糖基化位点，其疏水的氨基酸分布具有I型膜蛋白特征，如类EGF重复以及与IL－2受体的序列同源［1，2］。并且它包含一个上皮生长因子样的重复区、一个甲状腺球蛋白样重复区，其分子羟基端含有潜在的丝氨酸和酪氨酸磷酸化位点和一个磷脂酰基－肌醇结合共有序列［3］。TROP2在人体正常组织及体细胞成熟组织中很少表达，甚至几乎没有表达。但研究发现，TROP2在结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、口腔鳞状上皮细胞癌以及食管鳞状细胞癌等多种类型的人类恶性肿瘤组织中均高表达［4－8］。由此我们推测，TROP2是一种新的原癌基因，与多种肿瘤的发生发展具有密切的相关性。本论文主要通过在正常细胞内过表达TROP2来研究它在肿瘤发生中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人正常肝细胞L02购自上海细胞库。

1.2 重组质粒的构建 用Trizol法提取HepG2总RNA，并将mRNA逆转录为cDNA，之后用TROP2特异性引物通过PCR方法扩增TROP2的编码序列，TROP2的正向引物：5’－GGAATTCATGGCTCGGGGCCCCGGCCTCGC－3’；逆向引物：5’－GCTCTAGAGGGTACCTACAAGCTCGGTTCCTTTC－3’。将PCR产物用EcoRI和XbaI酶切后连接入pcDNA3中，构建pcDNA3－TROP2。

1.3 细胞培养及转染 LO2细胞分别在含10%新生胎牛血清的DMEM培养基中培养，并加入青霉素（100U／ml）和链霉素（100U／ml），培养条件为5%CO2，37℃。在6孔板中，每孔接种6×105个细胞，培养至细胞密度达到70－90%，以一孔细胞为例，吸净细胞上清液，D－Hank’s清洗，换用无血清及无双抗的DMEM培养液，将10μl Gene Trans滴入250μl无血清及无双抗的DMEM培养液中，混匀，室温静置5min，再将9μg质粒滴入无血清及无双抗的DMEM培养液中，混匀，将质粒－DMEM混合液逐步滴入Gene Trans－DMEM混合液中，混匀，室温静置20min，然后滴加在含完全培养基的细胞上清中，继续培养4h后，改用含双抗及含10%新生胎牛血清的DMEM培养基继续培养24－48h。

1.4 构建TROP2过表达的LO2稳转细胞系 LO2细胞用含10%FBS的DMEM培养基于37℃，5% CO2条件下培养。转染前24h以每孔1×106个细胞接种于6孔板，每孔2ml。转染时细胞密度达到80%左右。按照Gene Trans说明书将pcDNA3及pcDNA3－TROP2质粒分别转入LO2细胞。转染48h后，用500μg／ml浓度的G418持续筛选2周左右，挑取单克隆细胞株扩大培养，获得稳转细胞系。

1.5 Western blot 提前24h将细胞铺于6孔板，至提蛋白时细胞处于对数生长期。PBS洗涤细胞，5 000rpm，离心5min，重复3次，每孔（6孔板）加入200μl裂解液，冰上30min，每隔5min涡旋振荡一次，以使细胞充分裂解。12 000rpm离心10min后，将上清移入EP管，加入4×上样buffer，煮样10 min，使蛋白变性。取样品上样，电泳。配制转膜缓冲液并于4℃预冷。将PVDF膜用甲醇浸泡40sec，取出后浸泡于转膜缓冲液中备用。将方盘中放入转膜缓冲液，在液面下进行转膜装置的安装。并将转膜装置放入电泳槽中，倒入转膜缓冲液，100V转膜2h后取出PVDF膜，将膜标记正反面及电泳方向。用TBST（0.2%的Tween20）洗涤PVDF膜5min 2次，再用5%的脱脂奶粉4℃封闭过夜。之后用TBST（0.2%的Tween20）快速冲洗2遍，再洗涤15 min 1次，5min 4次（洗膜时均放于摇床上，以下同）。将用TBST稀释后的一抗与PVDF膜一同装入杂交袋中，放于摇床室温4h。取出PVDF膜，用TBST（0.2%的Tween20）快速冲洗2遍，再洗涤15 min 1次，5min 4次。将用TBST稀释后的二抗与PVDF膜一同装入杂交袋中，放于摇床室温2h。取出PVDF膜，用TBST（0.2%的Tween20）快速冲洗2遍，再洗涤15min 1次，10min 4次。将PVDF膜拿入暗室，ECL显影。

1.6 MTT 0.25%胰酶消化各实验组细胞后，用含10%FBS的DMEM培养基配成单细胞悬液，以每孔1×103个细胞铺于96孔板，每孔体积200μl，每种细胞设3个平行孔，共铺8块板。将培养板移入37℃，5%CO2孵育箱中培养，每隔24h取出1块板，每孔加入MTT溶液（5mg／ml）20μl，37℃继续培养4h。小心吸弃孔内的液体，每孔加入200μl DMSO，振荡10min，使结晶物溶解。选择OD570，使用酶标仪测定各孔的光吸收值。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制曲线。

1.7 细胞运动实验 0.25%胰酶消化各实验组细胞后，用含10%FBS的DMEM培养基配成单细胞悬液，以每孔1×106个细胞铺于6孔板，每孔2ml，每种细胞设2个平行孔。24h后，细胞基本铺满整个孔，用大枪头刮细胞表面，出现大约5mm宽的划痕区。将各培养孔中培养基用新鲜的无血清培养基替换后继续培养，以防止划落的细胞重新落入划痕区。继续培养24－48h后观察，并每隔24h拍照一次进行记录。

1.8 统计学分析 采用卡方检验对实验数据进行分析，P＜0.05表示统计学差异显著，P＜0.01表示统计学差异非常显著。所有数据均用SPSS10.0软件统计分析。

2 结果

2.1 过表达TROP2稳转细胞株的建立及鉴定为了研究TROP2基因的功能，本研究将pcDNA3－TROP2重组质粒转入LO2细胞，同时以转染pcDNA3质粒的LO2细胞做对照。将两种转染细胞用G418持续筛选2周，挑取单克隆细胞株扩大培养，从而获得过表达TROP2的LO2稳转细胞株。提取胞浆蛋白，之后进行Western blot，检测细胞中TROP2的表达。结果显示，在pcDNA3－TROP2稳转细胞中，与pcDNA3稳转细胞及未转染的LO2细胞相比，TROP2蛋白表达水平显著升高（图1），说明已成功建立了TROP2稳定表达细胞株。

图1 Western blot方法鉴定稳转细胞中TROP2的表达

2.2 过表达TROP2对细胞体外增殖能力的影响分别将转染pcDNA3、pcDNA3－TROP2质粒的LO2细胞以相同密度（1×103个／孔）铺于96孔板，进行MTT检测，以分析各组细胞的体外增殖能力。实验结果如图2所示，从第3天开始，转染pcDNA3－TROP2质粒的细胞比转染pcDNA3质粒的细胞活力明显增高（P＜0.05），提示过表达TROP2后可以显著增强LO2细胞的体外增殖能力。

2.3 过表达TROP2对细胞运动能力的影响 以每孔1×106个细胞的密度将两组细胞分别铺于6孔板，24h后细胞基本铺满整个孔，然后用大枪头刮细胞表面，出现一道约5mm的划痕区，换成新鲜的无血清培养基培养，24h及48h分别在显微镜下观察划痕区的宽度并进行拍照记录。实验结果如图3所示，转染pcDNA3－TROP2质粒的细胞划痕区宽度明显比转染pcDNA3质粒的细胞变窄。这说明过表达TROP2的LO2细胞运动能力明显增强。

图2 过表达TROP2对细胞活力的影响

图3 细胞划痕试验检测细胞的运动能力

3 讨论

恶性肿瘤已成为严重威胁人类健康的一类疾病，其发病率和死亡率逐年上升，而恶性肿瘤难以根治的一个重要原因就在于目前针对肿瘤发生的具体机制还不是十分清楚。现有研究表明，肿瘤是由多因素引起、多基因参与并经历了多阶段的演变过程，其中原癌基因的活化在肿瘤发生发展的过程中起着重要作用。人类滋养层细胞表面抗原（TROP2）基因，即肿瘤相关钙信号转导因子2，是1995年首次被克隆出来的新基因［1，2］。研究发现，TROP2在人体正常组织及体细胞成熟组织中很少表达，甚至几乎没有表达，但是却发现它在结肠癌、直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、口腔鳞状上皮细胞癌以及食管鳞状细胞癌等多种类型的人类恶性肿瘤中均高表达［4－8］。因此推测TROP2是一种新的原癌基因，并与多种肿瘤具有密切的相关性。但是对TROP2基因的功能和它在肿瘤发生发展中的作用以及如何引起肿瘤发生的机制等方面的研究还不是十分清楚。本文在正常细胞中过表达TROP2后，发现正常细胞有恶性转化的现象，表明TROP2在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。

为了确切研究TROP2基因的结构与功能，以及它在肿瘤发生发展中的作用，本文采用了基因转染的方法，这是目前应用最多、技术最成熟的研究基因功能的方法之一。此方法是将目的基因转入某一细胞后，通过不同检测手段及观察该细胞生物学行为的变化，从而了解该基因功能。因基因的表达受转染效率和是否持续稳定表达两方面因素的影响，所以本文又采用了稳定转染的方法，即将pcDNA3－TROP2重组质粒转入LO2细胞，并以转染pcDNA3质粒和GFP质粒的细胞做对照，然后在G418选择压力下持续筛选2周，从而获得过表达TROP2的稳转细胞株。之后，采用Western Blot方法从蛋白质水平来鉴定稳转细胞株中TROP2的表达。

我们用MTT法分别检测了转染pcDNA3及pcDNA3－TROP2质粒的LO2细胞以及未转染的LO2细胞的体外增殖能力，并绘制了连续8d的生长曲线，从图14中我们可以看出过表达TROP2基因的细胞株的体外增殖能力明显增强。说明TROP2在促细胞生长中发挥了重要作用。

正常细胞外粘着糖蛋白，可增强细胞与细胞外基质间的粘着。而癌细胞的纤粘连蛋白显著减少或缺失，钙粘蛋白合成发生障碍，从而破坏了细胞与基质之间和细胞与细胞之间的粘着，所以癌细胞与其同源正常组织细胞相比，细胞与细胞间、细胞与基底物间的粘着性明显降低，在体内容易分散和转移。对此我们采用细胞划痕试验对过表达TROP2细胞株的运动能力进行了分析。细胞划痕法是借鉴体外细胞致伤愈合试验模型，来测定肿瘤细胞在细胞外基质上的运动能力。我们研究发现，转染pcDNA3－TROP2质粒的LO2细胞在24h内与对照组细胞的运动能力相比明显增强，说明TROP2在促细胞转移中发挥了重要作用。

综上所述，本研究结果提示TROP2的过表达与肿瘤的发生、发展密切相关，从而为阐明肿瘤的发生机制以及肿瘤的治疗提供了新的途径。

［1］Linnenbach AJ，Wojcierowski J，Wu SA，et al.Sequence investigation of the major gastrointestinal tumor－associated antigen gene family，GA733［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1989，86：27.

［2］Chong JM，Speicher DW.Determination of disulfide bond assignments and N－glycosylation sites of the human gastrointestinal carcinoma antigen GA733－2（CO17－1A，EGP，KS1－4，KSA，and Ep－CAM）［J］.J Biol Chem，2001，276：5804.

［3］Basu A，Goldenberg DM，Stein R.The epithelial／carcinoma antigen EGP－1，recognized by monoclonal antibody RS7－3G11，is phosphorylated on serine 303［J］.Int J Cancer，1995，62：472.

［4］Zhang L，Zhou W，Velculescu VE，et al.Gene expression profiles in normal and cancer cells［J］.Science，1997，276：1268.

［5］Tsujikawa M，Kurahashi H，Tanaka T，et al.Identification of the gene responsible for gelatinous drop－like corneal dystrophy［J］.Nat Genet，1999，21：420.

［6］Ohmachi T，Tanaka F，Mimori K，et al.Clinical significance of TROP2expression in colorectal cancer［J］.Clin Cancer Res，2006，12：3057.

［7］Ohmachi T，Tanaka F，Mimori K，et al.Clinical significance of TROP2expression in colorectal cancer［J］.Clin Cancer Res，2006，12：3057.

［8］Fong D，Spizzo G，Gostner JM，et al.TROP2：a novel prognostic marker in squamous cell carcinoma of the oral cavity［J］.Mod Pathol，2008，21：186.

Effect of overexpression of TROP2 on cell proliferation and mobility

CUI Ni1，LI Ming2，NI Jin－song2，et al.（1.College of Clinical Medicine，Jilin University，Changchun130021，China；2.Department of Pathology，the First Hospital of Jilin University，Changchun130041，China）

Objective To investigate the effect of overexpression of tumor－associated calcium signal transducer2（TROP2）on cell proliferation and mobility.Methods Construction of TROP2expression vector pcDNA3－TROP2，and transfected it into human normal liver cell L02with Gene Trans，then screening of stable expression of TROP2cells by G418.we further investigate the cell viability by using MTT mathod and cell mobility by using scratch test.Results constructed TROP2－overexpression cell line successfully，further result revealed that overexpression of TROP2enhanced cell viability and mobility.Conclusion Overexpression of TROP2can promote tumorigenesis，these results provided a new target for clarifing mechanism of tumorigenesis and tumor therapy

TROP2；tumorigenesis；proliferation；mobility

R730.231

A

2014－09－15）

1007－4287（2015）06－0879－04

＊通讯作者