黄芪多糖配伍三七总皂苷对糖尿病模型大鼠肾脏保护作用研究

蒋 赛彭晓珊黄志华王硕辉谢 月唐映红，2

·论 著·

黄芪多糖配伍三七总皂苷对糖尿病模型大鼠肾脏保护作用研究

蒋 赛1彭晓珊1黄志华1王硕辉1谢 月1唐映红1，2

目的 探讨黄芪多糖与三七总皂苷配伍对糖尿病大鼠肾脏功能的保护作用。方法 SPF级SD大鼠60只，10只为正常对照组，50只予腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型，将糖尿病模型大鼠随机分为模型组、黄芪多糖组、三七总皂苷组、黄芪多糖与三七总皂苷配伍组、贝那普利组，每天给相应药物1次，连续8周。8周后测定各组大鼠24h尿总蛋白、血糖、血肌酐和尿素氮；取肾脏进行病理组织学检查。结果 与正常对照组比较，模型组大鼠24h尿总蛋白［（103.76±4.67）mg/24h比（13.82±4.49）mg/24h］、血糖［（28.44±3.74）mmol/L比（6.59±1.11）mmol/h］、血肌酐［（111.91± 9.46）μmol/L比（44.78±4.12）μmol/L］和尿素氮［（10.90±1.76）mmol/h比（5.53±1.27）mmol/L］显著升高（P<0.01）；病理组织学检查可见模型组大鼠肾小球基底膜增厚，肾小管出现大量炎症细胞浸润，间质纤维化；与模型组比较，黄芪多糖组大鼠尿蛋白［（84.01±7.20）mg/24h］、血糖［（20.60±2.10）mmol/ L］和肌酐［（80.58±4.52）μmol/L］明显下降（P<0.05）；三七总皂苷组大鼠血糖［（21.86±4.08）mmol/ L］和肌酐［（77.79±5.59）μmol/L］下降（P<0.05）；黄芪多糖和三七总皂苷配伍组大鼠尿蛋白［（66.00± 3.43）mg/24h］、血糖［（16.34±2.34）mmol/L］、肌酐［（68.94±3.22）μmol/L］和尿素氮［（7.43±1.48）mmol/ L］含量均明显下降（P<0.01）。各给药组肾脏病理改变均有不同程度改善。结论 黄芪多糖与三七总皂苷配伍对糖尿病大鼠的肾脏具有保护作用，其作用优于黄芪多糖和三七总皂苷单用组。

大鼠；糖尿病肾病；肾功能；黄芪多糖；三七总皂苷；链脲佐菌素

糖尿病病程2年以上，临床虽无肾病表现，而肾小球基底膜已有增厚；糖尿病10～20年，糖尿病肾病的发病率为30%～50%，糖尿病肾病患者有66%死于尿毒症[1]。研究表明，黄芪多糖能有效改善糖尿病肾病患者的临床症状，降低24h尿蛋白，显著改善肾功能，可降低餐后血糖，改善脂质代谢[2-4]。三七总皂苷可降低糖尿病肾病患者尿蛋白、β2-微球蛋白，改善肾功能[5-6]。黄芪多糖和三七总皂苷均可改善糖尿病肾病患者的肾功能，但两者合用是否产生协同作用尚未见报道。本研究观察黄芪多糖配伍三七总皂苷对糖尿病模型大鼠肾脏保护作用，报道如下。

1 实验材料

1.1 动 物 SPF级SD雄性大鼠60只，体质量（200±20）g，由湖南斯莱克景达实验动物公司提供，动物许可证号：SCXK（湘）2011-0003。大鼠饲以标准颗粒饲料，12h交替光线照明，室内通风良好，室温20～25℃，相对湿度40%～50%。

1.2 药 品 黄芪多糖（批号UD130927，含量：77%，陕西昂盛生物医药科技有限公司提供）；三七总皂苷[批号130628，含量：93.8%，广西梧州制药（集团）股份有限公司]；盐酸贝那普利片（批号AE2013 0902，规格：10mg/片，深圳信立泰药业股份有限公司）。链脲佐菌素（STZ）（批号9058035，北京Solarbio科技有限公司）。

1.3 仪器及ONETOUCH 血糖测量仪及血糖试纸:强生公司生产；PUS-2018G半自动生化分析仪：北京普朗新技术有限公司生产。总蛋白试剂盒、血糖试剂盒、肌酐试剂盒、尿素氮试剂盒由中生北控生物科技股份有限公司提供。

2 实验方法

2.1 分组与造模 大鼠适应性饲养1周后，禁食16h，取50只大鼠予一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）60mg/kg（用0.1mol/L、pH4.4柠檬酸缓冲液在冰浴上配制1%STZ），给药体积为6mL/kg，正常对照组10只则注射等体积的柠檬酸缓冲液。STZ注射72h后，尿糖（+++），血糖高于16.7mmol/L者确定为糖尿病大鼠。将成模大鼠随机分为模型对照组、黄芪多糖组、三七总皂苷组、黄芪多糖和三七总皂苷配伍组以及贝那普利组，每组10只大鼠。

2.2 给 药 正常对照组与模型组分别予蒸馏水灌胃；黄芪多糖组给予黄芪多糖300mg（/kg·d）灌胃；三七总皂苷组给予三七总皂苷（100mg（/kg·d）灌胃；配伍组给予黄芪多糖300mg（/kg·d）+三七总皂苷100mg（/kg·d）灌胃；贝那普利组给予贝那普利0.9mg（/kg·d）灌胃，每天给药1次，给药体积均为10mL/kg，连续8周。

2.3 标本采集及指标检测 末次给药后，收集各组大鼠24h尿液，测定尿量后离心，取上清液检测尿总蛋白。大鼠称重后，10%水合氯醛0.35mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血约10mL，分离血清，采用双缩脲法测定大鼠尿液中总蛋白的含量。采用葡萄糖氧化酶法测定大鼠血清中葡萄糖的含量。采用苦味酸法测定大鼠血清中血肌酐的含量。采用酶偶联速率法测定大鼠血清中尿素氮含量。取出双测肾脏称重，计算肾脏器系数。取左肾用pH7.4、10%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规切片进行病理组织学检查。

2.4 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件，数据以（±s） 表示，组间比较采用单因素方差分析。

3 实验结果

3.1 一般情况 实验过程中正常对照组和各给药组均有1只大鼠死亡，模型组实验过程中死亡3只。正常对照组大鼠精神状况良好，皮毛有光泽，活动自如，反应灵敏；糖尿病模型组大鼠精神逐渐萎靡、明显消瘦、多尿、多饮、毛色发黄无光泽，反应迟钝；各给药组大鼠精神状况，反应灵敏度均比模型组大鼠要好。

3.2 各组大鼠体质量变化和肾脏器系数比较 与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠体质量明显下降（P<0.01），肾脏脏器系数明显增加（P<0.01）；与模型组比较，黄芪多糖组、三七总皂苷组大鼠体质量明显增加（P<0.05），其肾脏脏器系数虽然有所下降，但差异无统计学意义（P>0.05）；与模型组比较，黄芪多糖与三七总皂苷配伍组大鼠体质量明显增加（P<0.01），肾脏脏器系数降低（P<0.05），黄芪多糖与三七总皂苷配伍组大鼠体质量增加幅度高于黄芪多糖和三七总皂苷单用组（P<0.05），肾脏脏器系数增加幅度低于黄芪多糖和三七总皂苷单用组（P<0.05），见表1。3.3 各组大鼠24h尿总蛋白含量比较 与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠尿总蛋白明显增加（P< 0.01）；与模型组比较，黄芪多糖组和三七总皂苷组大鼠尿蛋白含量明显降低（P<0.01，P<0.05）；与模型组比较，黄芪多糖、三七总皂苷配伍组大鼠尿蛋白含量明显降低（P<0.01），黄芪多糖组和三七总皂苷配伍组降低尿蛋白的作用优于黄芪多糖组和三七总皂苷组（P<0.05）。配伍组与贝那普利组比较各指标差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 各组大鼠体质量比较（±s）

表1 各组大鼠体质量比较（±s）

注：与正常对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与黄芪多糖组比较，▲P<0.05；与三七总皂苷组比较，▽P<0.05

组别正常对照组模型组黄芪多糖组三七总皂苷组配伍组贝那普利组只数979999体质量（g）411.46±37.90 264.15±22.09** 304.8±34.92△296.40±27.04△333.42±20.00△△▲▽335.56±30.48△△▲▽肾脏脏器系数（mg/g）6.29±0.26 10.97±2.08** 10.20±0.33 10.08±0.42 8.44±0.53△▲▽9.22±0.37△▲▽尿总蛋白（mg/24h）13.82±4.49 103.76±4.67** 84.01±7.20△△96.82±6.87△66.00±3.43△△▲▽65.08±2.60△△▲▽

3.4 各组大鼠血清生化指标比较 与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠血糖、肌酐、尿素氮含量均显著增加（P<0.01）；与模型组比较，黄芪多糖组和三七总皂苷组大鼠血糖、肌酐、尿素氮含量明显降低（P< 0.05，P<0.01）；与模型组相比，黄芪多糖与三七总皂苷配伍组血糖、肌酐、尿素氮含量明显降低（P< 0.01）；黄芪多糖与三七总皂苷配伍组降低血糖、肌酐、尿素氮作用优于黄芪多糖组与三七总皂苷组（P< 0.05）。见表2。

3.5 肾脏病理组织学检查 正常对照组大鼠肾小管、肾小球结构清晰，间质无炎症和纤维变化；模型组大鼠肾小球体积增大，基膜增厚，球内血管缩小甚至闭合，肾小管出现大量炎症细胞浸润，管型蛋白，间质纤维化。各用药组上述病理改变均有不同程度减轻，而黄芪多糖和三七总皂苷配伍组大鼠肾脏病理改变减轻尤为明显。见图1（封二）。

4 讨 论

建立糖尿病动物模型的方法有很多，包括胰腺切除术诱导法、化学药物诱导法（如链脲佐菌素、四氧嘧啶等）、拮抗胰岛素因子诱导法、食物诱发及催肥等[7]。其中化学药物诱导糖尿病操作简单，造模时间短，是目前制备糖尿病动物模型的首选方法[8]。目前建立糖尿病大鼠模型普遍使用腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ），STZ是一种广谱抗生素，对实验动物的胰岛β细胞具有高度选择性的毒性破坏作用，减少胰岛素合成。腹腔注射STZ可诱导大鼠形成糖尿病，采用腹腔单次注射60mg/kg STZ建立糖尿病大鼠模型，具有建模方法简便、稳定性高、死亡率低，胰岛β细胞损害特异性高等优点[9]。STZ可诱导糖尿病大鼠肾脏功能和结构受损，腹腔注射STZ后一定时间大鼠血肌酐、尿素氮、尿蛋白明显升高，病理组织学检查可见肾小球明显增大、肿胀，基底膜增厚，肾小球硬化，肾间质纤维化等,因此大鼠腹腔注射STZ可形成糖尿病肾病[10-11]。而腹腔注射STZ 60mg/ kg是致糖尿病SD大鼠发生肾病的最佳剂量[12]。

糖尿病肾病是糖尿病微血管并发症之一，是导致终末期肾功能衰竭重要原因。糖尿病肾病的主要病理特征是肾小球和肾小管肥大，基底膜增厚，细胞外基质（ECM）的大量堆积和肾小球硬化等[11]。高血糖时，氧自由基增加，并造成膜蛋白及脂质过氧化，使膜通透性增加，血液中大分子物质沉积在基底膜，导致基底膜增厚，损伤肾小球基底膜，导致肾功能障碍[13-14]。

表2 各组血清生化指标比较（±s）

表2 各组血清生化指标比较（±s）

注：与正常对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与黄芪多糖组比较，▲P<0.05；与三七总皂苷组比较，▽P<0.05。APS：黄芪多糖；PNS：三七总皂苷

组别正常对照组模型组黄芪多糖组三七总皂苷组配伍组贝那普利组只数 剂量（mg/kg）979999 --300 100 APS300、PNS100 0.9血糖（mmol/L）6.59±1.11 28.44±3.74** 20.60±2.10△△21.86±4.08△△16.34±2.34△△▲▽16.18±3.33△△▲▽肌酐（μmol/L）44.78±4.12 111.91±9.46** 80.58±4.52△△77.79±5.59△△68.94±3.22△△▲▽64.32±3.51△△▲▽尿素氮（mmol/L）5.53±1.27 10.90±1.76** 8.81±1.33△8.96±1.30△7.43±1.48△△▽7.39±2.18△△▽

本研究表明，大鼠腹腔注射STZ 60mg/kg后出现精神萎靡、明显消瘦、多尿、多饮、皮毛无光泽，反应迟钝。8周后糖尿病大鼠尿蛋白排泄增加，血糖、肌酐和尿素氮含量升高；病理组织学检查可见大鼠肾小球基底膜增厚，球内血管缩小甚至闭合，肾小管出现大量炎症细胞浸润，管型蛋白，间质纤维化。在诱导糖尿病的早期给予黄芪多糖、三七总皂苷治疗后，大鼠体质量减轻、多饮、多食、多尿等症状改善；大鼠24h尿蛋白排泄明显减少，血肌酐和尿素氮明显降低，肾脏病理学损伤明显减轻，表明黄芪多糖、三七总皂苷可减少尿蛋白的排出，有效防止或延缓糖尿病肾病的病理学进展，对糖尿病所诱导的肾脏损害有一定的保护作用，结果与文献报道一致[15-16]。本研究也表明，黄芪多糖和三七总皂苷配伍后降低糖尿病大鼠血糖、减轻肾脏损害，作用优于黄芪多糖、三七总皂苷单用组，提示黄芪多糖配伍三七总皂苷可以产生协同作用，延缓糖尿病大鼠肾病的发生。

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（收稿：2015-00-00 修回：2015-00-00）

Effect of Astragalus Polysaccharides Combined w ith Panax Notoginseng Saponins on K idney of Rats w ithDiabetic Nephropathy

JIANG Sai1,PENG Xiaoshan1,HUANG Zhihua1,WANG Shuohui1,XIE Yue1,TANG Yinghong1,2. 1 Department of Pharmacology,College of Pharmacy,Hunan University of Traditional Chinese Medicine,Changsha 410208,China;2 Key Lab of Modernization of Chinese Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,China

Objective To investigate effect of Astragalus Polysaccharides（APS）combined with Panax Notoginseng saponins（PNS）on kidney of rats with diabetic nephropathy.M ethods Diabetic nephropathy was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin.A total of 50 diabetic rats were randomlydivided into model group,APS group,PNS group,PNS combined with APS group,benazeprilgroup.Rats were administered the corresponding drug intragastrically dailyfor 8 weeks.Urinary protein level in 24h,blood sugar,blood creatinine,and urea nitrogen level and histopathological examination of the kidney were determined.Another 10 rats served as normal control.Results Urinary protein level in 24h,blood glucose,creatinine,and urea nitrogen level in rats in model group were significantly higher than those in normal control group（103.76±4.67mg/24h vs 13.82±4.49mg/24g,28.44±3.74mmol/L vs 6.59±1.11mmol/L,111.91±9.46μmol/L vs 44.78±4.12μmol/L,and 10.90±1.76mmol/h vs 5.53±1.27mmol/L;all P< 0.05）.Histopathological examination showed glomerular basement membrane thickening,a large number of inflammatory cell infiltration into tubular,and interstitial fibrosis.Compared with model group,APS reduced urinary protein to 84.01±7.20mg/24h,blood glucose to 20.60±2.10mmol/L,and creatinine content to 80.58±4.52μmol/L（all P< 0.05）;PNS decreased blood glucose to 21.86±4.08mmol/L and creatinine content to 77.79±5.59μmol/L（all P<0.05）;in compatibility groupurinary protein,blood glucose,creatinine,and urea nitrogen content were further lowedto 66.00±3.43mg/24h,16.34±2.34mmol/L,68.94±3.22μmol/L,and 7.43±1.48mmol/L（all P<0.05）.Renal pathological changes had greatly improved in treatment groups.Conclusion APS combined with PNS haveprotective effect on kidney of rats with diabetic nephropathy,and the effect was better than that ofAPS and PNS alone.

Diabetic nephropathy;Kidney function;Astragalus Polysaccharides;Panax Notoginseng saponins; Streptozotocin

湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目湘教通[2012]（No.402-187）；2012地方高校国家级大学生创新训练计划项目（No. 201210541005）

1湖南中医药大学药学院药理教研室（长沙410208）；2湖南中医药大学中药现代化重点实验室（长沙410208）

唐映红，Tel：0731-88458238；E-mail：tyhong62@qq.com