固相萃取-高效液相色谱法测定人血浆中的替硝唑浓度

郭志磊，孔 敏

固相萃取-高效液相色谱法测定人血浆中的替硝唑浓度

郭志磊，孔 敏*

目的 建立固相萃取结合高效液相色谱法测定人血浆中替硝唑浓度的方法。方法 血浆样品经C18固相萃取小柱净化后进样。色谱柱：HyperSil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：磷酸二氢钾(含0.1%三乙胺，磷酸调pH=3.2)-乙腈(89∶11)，柱温：25 ℃，流速：1 mL/min，检测波长：236 nm，进样量：30 μL。结果 替硝唑血药浓度在0.5～50 mg/L之间呈良好线性关系(r=0.999 5)，线形方程Y=1.012 C-0.053 1，相对标准偏差<5%，回收率>90%。结论 该方法操作简便、准确可靠，灵敏度高，适用于替硝唑的血药浓度检测。

固相萃取；高效液相；替硝唑；血药浓度

0 引言

替硝唑属硝基咪唑类化合物，临床上主要用于治疗肠道和肠外阿米巴病及厌氧菌感染[1]。目前，高效液相测定替硝唑血药浓度的血浆处理方法是蛋白沉淀法。但采用蛋白沉淀法处理血样，内源性杂质干扰大，灵敏度不高[2-3]。而采用固相萃取处理替硝唑血浆还未见报道。经过对前期试验的研究改进[4]，本研究首次建立了固相萃取联合高效液相色谱法测定替硝唑血药浓度的方法，且具有简便、快速、准确、灵敏度高等优点，适合临床替硝唑的血药浓度监测。

1 仪器与试药

日本SHIMADZU公司高效液相色谱系统(SPD-20A检测器，CTO-10AS柱温箱，LC-20AD 四元泵)；Cleanert C18固相萃取柱(200 mg/3 mL，Agela Technology)。

替硝唑(中国药品生物制品检定所，批号：100336-200703)；甲硝唑(中国药品生物制品检定所，批号：100191-200606)；甲醇、乙腈均为色谱级(美国TEDIA公司)；磷酸二氢钾、磷酸、三乙醇为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：HyperSil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.05 mol/L磷酸二氢钾(含0.1%三乙胺，用磷酸调pH值至3.2)-乙腈(89∶11)；检测波长：236 nm；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：30 μL。

2.2 标准溶液的配制

2.2.1 替硝唑标准溶液的配制 精密称取替硝唑标准品10 mg，置于50 mL量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，配制成200 mg/L供试品溶液，于4 ℃下避光保存。

2.2.2 对照品溶液的配制 精密称取甲硝唑标准品10 mg，置于100 mL量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，配制成100 mg/L对照品溶液，于4 ℃下避光保存。

2.3 样品处理 取血浆样品0.2 mL，加入对照品溶液20 μL，涡旋振荡10 s后，置活化的固相萃取柱上。先用1 mL水冲洗，再用1 mL 90%甲醇淋洗，然后用20%冰醋酸甲醇溶液2 mL上柱洗脱，收集洗脱液于60 ℃水浴中用氮气吹干后，用0.5 mL蒸馏水溶解，取30 μL进样。

2.4 方法专属性 按上述色谱条件和血浆处理方法，替硝唑和甲硝唑分离度良好，峰形尖锐且无拖尾现象，血浆内源性杂质极少，对测定无干扰。空白血浆、替硝唑及甲硝唑色谱图见图1。甲硝唑和替硝唑的保留时间分别为5.8、8.7 min。

图1 高效液相色谱图

2.5 标准曲线的制备 取空白血浆180 μL，加入对照品溶液和供试品溶液各20 μL，使替硝唑血浆浓度分别为0.5、1、2、5、10、20、50 mg/L，按“2.3”项下处理，用样品峰与内标峰的面积比对样品浓度作线性回归，标准曲线：Y=1.012 C-0.053 1，r=0.999 5，表明替硝唑在0.5～50 mg/L浓度范围内线性关系良好。最低检测限为0.02 mg/L (信噪比S/N≥3)。

2.6 方法回收率和精密度试验 取替硝唑供试品溶液适量，依次配制低、中、高浓度(1、10、50 mg/L)的血浆样品，按“2.3”项下处理，3种浓度样品每日测定5次，连续测定5 d，计算方法回收率及日内、日间精密度(表1)。由表1可见，回收率>95%，精密度RSD均<5%，满足生物样品的测定要求。

2.7 稳定性试验 取替硝唑供试品溶液适量，配制浓度为1、10、50 mg/L的血浆样品，平行制备3份，按“2.3”项下处理，分别在室温条件(0、6、12、24、72 h)、冻融条件(冻融3次)下进行测定。结果显示，各样本测定值RSD均<10%，表明替硝唑在室温条件(72 h内)和冻融条件(3次)下稳定性良好。

表1 回收率和精密度试验(n=5)

2.8 方法学应用 收集我院2013年1-12月口腔科和妇科疾病患者血样(经医院伦理委员会通过，患者签署知情同意书)，共34例患者，男12例，女22例，年龄21～54岁，平均年龄(35.4±2.1)岁。测定口服1 g替硝唑片剂后的血药浓度，72 h内取血14点，结果显示，替硝唑血药浓度均在定量范围内。血药浓度-时间曲线见图2。

图2 替硝唑血药浓度-时间曲线

3 讨论

笔者对流动相体系进行考察[5-7]，流动相组成中无三乙胺时，替硝唑峰形不对称且有拖尾；但当流动相中三乙胺含量为0.1%时，替硝唑峰形对称无拖尾。而且还发现磷酸二氢钾与乙腈的比例对于测定影响较大，当磷酸二氢钾∶乙腈=89∶11时，内源性杂质干扰少，峰形较为尖锐。

已有文献中，研究者多采用磷酸盐乙腈或磷酸盐甲醇溶液作为洗脱剂[8-9]。但笔者通过实际操作发现，仍有少量内源性杂质干扰。本研究采用冰醋酸甲醇溶液作为洗脱剂，可以将替硝唑和甲硝唑从SPE柱上洗脱下来。此外，20%的冰醋酸甲醇溶液洗脱能力最强，而且杂质干扰较少。

朱余兵等[10]采用甲醇、乙腈等作为蛋白沉淀剂纯化血样，测定替硝唑血药浓度。但由于沉淀剂对替硝唑的部分吸附，导致该方法的最低检测限只能达到0.5 mg/L，还有内源性杂质的干扰。而本试验采用固相萃取法纯化血样，所需药品量少，样品处理简单，灵敏度高，适用于临床检测替硝唑血药浓度。

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Determination of the concentration of tinidazole in human plasma by HPLC with solid phase extraction

GUO Zhi-lei,KONG Min*

(Affiliated Hospital of Jianghan University,Wuhan 430015,China)

Objective To establish a new solid phase extraction (SPE)-HPLC method for the determination of tinidazole in plasma.Methods The plasma samples were cleaned up by SPE.The HyperSil C18column (250 mm×4.6 mm,5 μm) was used,and the mobile phase consisted of phosphate buffer-acetonitrile (89∶11).The flow rate was 1 mL/min with the detection wavelength of 236 nm,and the column temperature was 25 ℃.Results The linear relation was in the range of 0.5～50 mg/L (r=0.999 1),RSDof intra-day and inter-day were both less than 5%,and the recovery rate was more than 90%.Conclusion The method is convenient,rapid and accurate,it is suitable for the assay of tinidazole in plasma.

Solid phase extraction;High performance liquid chromatography;Tinidazole;Plasma drug concentration

2014-05-18

江汉大学附属医院，武汉 430015

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201502017