紫外分光光度法测定不同产地黄芪总黄酮的含量*

★ 程研闵会何厚洪胡江宁吴健王小东王如伟（1.浙江中医药大学 杭州1005；.浙江康恩贝药品研究开发有限公司 杭州 1005；.大兴安岭地区食品药品检验检测所 黑龙江鹤岗 165000；4.浙江康恩贝制药股份有限公司（浙江省中药制药技术重点实验室） 杭州 1005）

紫外分光光度法测定不同产地黄芪总黄酮的含量*

★ 程研1**闵会2何厚洪2胡江宁2吴健2王小东3王如伟1,4***（1.浙江中医药大学 杭州310053；2.浙江康恩贝药品研究开发有限公司 杭州 310052；3.大兴安岭地区食品药品检验检测所 黑龙江鹤岗 165000；4.浙江康恩贝制药股份有限公司（浙江省中药制药技术重点实验室） 杭州 310052）

目的：建立黄芪中总黄酮的含量测定方法，比较不同产地黄芪药材总黄酮的含量。方法：以毛蕊异黄酮苷为对照品，采用紫外分光光度法，测定波长为260 nm，对不同产地黄芪药材总黄酮的含量进行测定。结果：毛蕊异黄酮苷在4～20μg/m L呈现良好的线性关系，r=0.9999，平均回收率为99.96%，RSD%为1.53%；不同产地黄芪药材，总黄酮含量在0.234%～0.383%范围内。结论：本实验建立的方法适用于测定黄芪药材中总黄酮的含量；不同产地黄芪中总黄酮含量以毛蕊异黄酮苷计由高到低依次为大兴安岭、甘肃、山西、内蒙古。

紫外分光光度法；毛蕊异黄酮苷；总黄酮；含量测定

黄芪为豆科植物蒙古黄芪AstragaLus membranaceus（F isch.）B g e.v a r.m on g ho L icus（B g e.）H si a o或阳、利水消肿之功效[5]。现代药理研究表明，黄酮类成分为黄芪抗肿瘤的有效成分之一[6]，王光忠[7]、陈鑫[8]、李春红[9]等分别以芦丁为对照，对黄芪中总黄酮的含量进行了测定。郭帅等[10]在研究黄酮纯化工艺时则以毛蕊异黄酮苷为对照，对总黄酮进行测定。但通过杨范莉[11]、冯祖飞[12]、梁瑾[13]等对黄芪药材中黄酮类成分的研究表明，其黄酮类成分中以毛蕊异黄酮苷的含量最高。因此作者选择以毛蕊异黄酮苷为对照，对黄芪药材中总黄酮含量测定方法进行系统研究，测定结果真实、可靠，可以为黄芪药材中黄酮类成分深入研究提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UV-2450型紫外分光光度计（日本岛津）；AgiLent1200高效液相色谱仪（AgiLent公司）；BS210S电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；AX 205电子天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；HWS26型恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）。

1.2 材料与试药 山西、内蒙古、甘肃及大兴安岭黄芪药材（购自磐安康恩贝药材发展有限公司）；毛蕊异黄酮苷（纯度≥99%，批号：130312，上海盛中医药化工有限公司）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 取毛蕊异黄酮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1m L含0.5052m g的溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备 分别取样品粉末（过四号筛）约0.5 g，精密称定，置茄形瓶中，精密加入70%乙醇50m L，加热回流3 h，滤过，滤液合并，浓缩至近干。加10m L水使溶解，转移至60m L分液漏斗中，加水饱和正丁醇振摇提取3次，每次25m L，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10m L量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得各样品的供试品溶液。

2.3 测定波长的选择 精密量取对照品溶液和供试品溶液1.0m L，分别置25m L量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，在900～190 n m波长范围内扫描，结果对照品溶液和供试品溶均在260 n m处有特征吸收峰。

2.4 测定法 精密量取供试品溶液1.0m L，置25m L量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，照紫外-可见分光光度法，在260 nm的波长处测定吸光度。

2.5 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.2, 0.4，0.6，0.8，1.0m L，分别置25m L量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光膜荚黄芪AstragaLusmembranaceus（F isch.）B g e.的干燥根[1]，主要含有黄酮、皂苷、多糖等[2-4]，具有补气升光度法，在260 nm的波长处测定吸光度，以吸光度（X）为纵坐标，浓度（Y）为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程为Y=55.897X-0.0007,r=0.9999，说明毛蕊异黄酮苷在4～20μg/m L范围内有良好的线性关系。

2.6 方法学验证

2.6.1 精密度试验 精密量取“2.2”项下供试品溶液1份，稀释25倍，于260 nm波长处平行测定吸光度6次，RSD为0.57%，精密度良好。

2.6.2 稳定性试验 精密量取“2.2”项下供试品溶液，稀释25倍，分别在0，1，2，4，6，24 h测定吸光度，RSD为4.95%，样品在24 h内稳定。

2.6.3 重复性试验 取6份黄芪粗粉，精密称定，参照“2.2”项下供试品溶液制备方法制备供试品，参照“2.4”项下测定法测定并计算总黄酮含量，结果RSD为1.41%，符合要求。

2.6.4 回收率试验 取黄芪粗粉约0.25 g共6份，精密称定，分别精密加入1m L毛蕊异黄酮苷对照品溶液（0.776mg/m L），精密加入70%乙醇50m L，摇匀，参照“2.2”项下供试品溶液制备方法制备供试品，参照“2.4”项下测定法测定并计算总黄酮含量，结果加样回收率为97.39%～101.50%，平均为99.96%，RSD为1.53%。

表1 不同产地黄芪药材中总黄酮含量（n=10）

2.7 样品的含量测定 参照“2.2”项下供试品溶液制备方法制备供试品，参照“2.4”项下测定法测定总黄酮含量，计算不同产地黄芪药材中总黄酮含量（表1）。

以毛蕊异黄酮苷计，不同产地黄芪药材中总黄酮的含量大小依次为大兴安岭＞甘肃＞山西＞内蒙。其中，大兴安岭地区黄芪药材中总黄酮含量普遍较高。但总体上看，各地黄芪药材中总黄酮含量相差不大。

3 讨论

3.1 对照品的选择 国内多以芦丁为对照品，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法测定黄芪药材中总黄酮的含量[14-16]。作者参照《中国药典》中芦丁的含量测定方法，利用HPLC法测定黄芪药材中芦丁和毛蕊异黄酮苷的含量，结果发现在供试品溶液的色谱图中未检测出明显的芦丁色谱峰，并且，通过计算得出药材中毛蕊异黄酮苷的含量为0.07%，约占总黄酮的20%，是黄芪药材中最主要的异黄酮类成分。汪德清等报道黄芪总黄酮中，异黄酮类化合物占74%[17]。《中国药典》黄芪项下亦确定毛蕊异黄酮苷作为药材质量的评价指标，因此作者选择以毛蕊异黄酮苷作对照，建立黄芪药材中总黄酮含量的测定方法。

3.2 供试品溶液制备的前处理过程筛选 南换杰[18]通过石油醚脱脂-乙醇提取，测定黄芪中总黄酮的含量。朱正兰[15]在石油醚脱脂-乙醇提取的基础上，增加了乙酸乙酯萃取的步骤，操作过程较为繁琐。作者试验过直接采用乙醇提取，以毛蕊异黄酮苷为对照品来测定黄芪中总黄酮的含量，但全波长扫描结果中未检测出最大吸收波长。参考朱正兰的样品前处理方法，采用70%乙醇提取、乙酸乙酯萃取的方法来制备供试品溶液，节省了样品前处理时间。之后，作者测定了转移后的溶液分别经乙酸乙酯萃取和水饱和正丁醇萃取后的含量，结果发现供试品溶液经水饱和正丁醇萃取后测得含量更高，通过H P L C法检测发现供试品溶液经水饱和正丁醇萃取后在254 n m下有紫外吸收的物质并未减少，而E L SD检测器检测到黄芪中部分物质被除去，因此我们确定了70%乙醇提取、水饱和正丁醇萃取测定黄芪中总黄酮含量的测定方法，可用于快速测定黄芪中总黄酮的含量。

3.3 不同产地黄芪药材中总黄酮的含量测定 由测定结果可以看出，大兴安岭产黄芪药材中总黄酮含量相对最高，且不同批次间相对稳定（含量为0.354%～0.383%），甘肃、山西产黄芪中总黄酮含量次之，内蒙古产黄芪药材中总黄酮含量最低。但总体来看，四个产地黄芪药材中总黄酮的含量差别不大。

上述试验建立的以毛蕊异黄酮苷为对照品，测定不同产地黄芪药材中总黄酮含量的方法操作简单、精密度高、结果准确可靠，可用于黄芪药材中总黄酮的含量测定和黄芪药材的质量控制。

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Determ ination of Flavonoid in AstragaLus Grown in Different Areas by UV Spectrophotometry

CHENG Yan1,M IN Hui2,HE Hou-hong2,HU Jiang-ning2,WU Jian2,WANG Xiao-dong3,WANG Ru-wei1,4
1.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China；
2.Zhejiang Conba Drug Research and Development CO.,LTD.,Hangzhou 310052,China；
3.Daxing'anling Food and Drug Inspection Institute,Hegang 165000,China；
4.Zhejiang Conba Pharmaceutiacl CO.LTD.（Zhejiang Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmaceutical Technology）,Hangzhou 310052,China.

Objective:To establish a new method for determining the contents of flavonoid in AstragaLus among different areas.Methods:Flavonoid in AstragaLuswas determined by UV spectrophotometry at the wavelength 260 nm,with calycosin-7-glucoside as index.And thismethod can be used for assaying of flavonoid in AstragaLus from different habitats.Results:The linear range of calibration curve was 4～20μg/mL,r=0.9999.The average recovery rate was 99.96%with the relative standard deviation 1.53%.The contents of flavonoid in AstragaLus were 0.234%～0.383%.Conclusion:Thismethod can be used for evaluation of quality of flavonoid in AstragaLus.The contents in flavonoid can be ranked as follows:Daxinganling>Gansu>Shanxi>Neimenggu.

UV Spectrophotometry;calycosin-7-glucoside;flavonoid;quantitativ-e determination

R284.1

A

2014-09-29）编辑：曾文雪

浙江省企业研究院项目（2010E90011）。

**第一作者：程研（1990-），女，硕士。研究方向：中药质量标准与质量控制。E-mail：18958046151@163.com。

***通信作者：王如伟，男，博士生导师。Tel:（0571）87774766，E-mai:wangrw@conbagroup.com。