漆斑菌Myrothecium sp.IMER1液体和固体发酵产胆红素氧化酶分析

刘友勋++闫明阳++黄娟++赵春澎

摘 要：为了提高漆斑菌Myrothecium sp.IMER1的胆红素氧化酶（bilirubin oxidase，BOX）产量，分析了其液体和固体发酵产酶的特性。首先分析了该菌株液体和固体发酵产BOX的时间变化曲线，对其所产的胞外酶进行了活性电泳，进一步分析了其液体产酶的模型和宏观动力学内容。结果表明，菌株IMER1在液体发酵中第5天的产BOX酶量最大，其固体发酵产酶量最大时间也是在第5天，但是，其固体发酵能持续高产BOX。从BOX的底物活性显色中可知，在固体和液体发酵的粗酶液中都能检测到BOX，并且没有同工酶出现；而BOX生物合成模式为中期合成型，通过数据计算和模拟得出了产酶动力学方程。

关键词：胆红素氧化酶；漆斑菌；液体发酵；固体发酵

中图分类号：TQ925 文献标识码：A DOI：10.15913/j.cnki.kjycx.2015.09.005

胆红素是一类线形四吡咯衍生物。在人体内，如果不能及时去除由于血红素降解而产生的胆红素，那么，过多的胆红素不仅会使皮肤变黄，产生黄疽，而且还具有明显的神经毒性，会导致耳聋、精神迟钝和大脑麻瘅，严重时还会致死。胆红素氧化酶（bilirubin oxidase，BOX，EC.1.3.3.5）是一种含铜的多酚氧化酶，它能催化胆红素氧化，而且氧气是其电子受体，具体的反应过程为BOX催化胆红素生成胆绿素，后者可进一步氧化，最终生成性质还不清楚的无色化合物。最早，BOX是在荷兰猪脑中被发现的，随后又发现了多种真菌，比如食用双孢蘑菇、青霉属和漆斑菌属也能分泌该酶。但是，自从日本学者发现漆斑菌属能高产BOX后，在临床医学中，开始尝试使用该酶来测定胆红素。这种方法具有特异性、灵敏高和操作简便等优点，适用于临床手工或自动化检测中。近年来，BOX的应用领域逐渐拓宽，被用于生物电池的制造、污水处理等研究中。最近也有文献报道指出，芽孢杆菌的孢子外壳蛋白也具有BOX活性，但是，细菌的BOX氧化能力比真菌的氧化能力要低，所以，工业生产BOX还是以漆斑菌发酵产酶为主。鉴于BOX应用范围的日益广泛，对其酶的需求量也在逐年提高，而如何改善漆斑菌发酵产BOX的能力，是目前面临的一大难题。在前期实验中，筛选到了一株能产生BOX的漆斑菌（Myrothecium sp.IMER1），本文拟通过分析其液体和固体发酵产酶的相关特性，为提高菌株IMER1产BOX的能力打下坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料和主要仪器

供试菌株 IMER1（Myrothecium sp.IMER1）；2，2-连氮-双-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）铵（ABTS，美国SIGMA公司）；马铃薯液体培养基（PDB）：马铃薯20%（削片煮水），质量分数为2%的葡萄糖；固体培养基：麸皮5 g，水15 mL。

UNICO-UV-2000型紫外可见分光光度仪（上海尤尼柯仪器有限公司）；TGL-16/TGL16台式高速冷冻离心机（湖南湘仪集团）；ZD-88全温气浴振荡摇床（金坛市成辉仪器厂）。

1.2 实验方法

1.2.1 液体培养

通常情况下，IMER1菌株的PDA斜面种5～7 d便可产生大量的分生孢子，用适量的蒸馏水将试管中的孢子冲洗出来，利用显微计数，将孢子数量调整到1×108/mL，用前将孢子悬浮液摇匀。用移液枪吸取1 mL孢子液注射入灭菌后100 mL的液体培养基中，将接种的培养基放在摇床中，在150 rpm下振荡培养。菌株IMER1在液体基质中培养一段时间后，将菌丝过滤即可得粗酶液。

1.2.2 固体培养

用移液枪吸取上述配制好的1 mL孢子液，将其注射入灭菌后的固体培养基中，然后放入恒温培养箱中培养（27 ℃）。菌株IMER1在固体培养基中培养一段时间后，加入50 mL的蒸馏水，然后振荡3 h，再过滤收集粗酶液。

1.2.3 酶活测定

ABTS法参见参考文献。在3 mL反应体系中，含有2.7 mL pH为4.5、物质的量浓度为0.2 mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液，0.1 mL的酶液，物质的量浓度为1 mol/L的 ABTS0.2 mL，按次序混合并摇匀，30 s后开始记录A420，每隔15 s记1个A420值。1个酶活力单位（U）在上述条件下，每分钟催化1 μmol ABTS氧化所需的酶量。

1.2.4 活性PAGE电泳

将玻璃板、胶垫和梳子用双蒸水洗干净，用酒精棉球擦拭，将电泳槽安装好，配制质量分数为12%的分离胶和质量分数为5%的浓缩胶。在配制过程中，不加入SDS，样品不需要加热变性。加入了电极缓冲液后，将样品（发酵液）用微量进样器点入点样孔底部，60 V电泳。当溴酚蓝到达分离胶时，电压改为150 V，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。将凝胶剥下，延泳道切成不同的小条块，分别浸泡在100 mL的不同的底物液（ABTS或胆红素）中，染色1～3 h，待胶带显色后立即照相。

1.2.5 还原糖的测定

将1 mL样品加入试管中，然后加入0.5 mL的 DNS，混匀放置沸水浴中水浴，5 min后取出加6 mL蒸馏水，混匀后于540 nm分光光度测量OD。

2 结果与分析

2.1 菌株IMER1在液体发酵中产BOX的时间曲线

菌株IMER1在液体发酵中产BOX的时间曲线如图1所示。

如图1所示，当培养了5 d左右时，菌株液体发酵产BOX酶量达到最大，酶量相对稳定，但是，随后缓慢下降。随着培养时间的增加，发酵液的颜色逐渐由灰色变成棕黄色，pH值从6.0上升到7左右。如图2所示，菌球随着时间的增加也逐渐变大，到后期慢慢开始溃解，最后大部分菌球会变成絮状，发酵液的黏度也会增加。上述结果表明，为了得到高酶活的BOX，应在发酵培养后的第5天左右收集滤液。如果在5 d之后去收集酶液，可能会对后续BOX酶的分离造成很大的影响。因为菌球的溃解会产生大量的杂蛋白，因此，在工业生产中，应该尽量避免在发酵后期收集酶液。

1.2.4 活性PAGE电泳

将玻璃板、胶垫和梳子用双蒸水洗干净，用酒精棉球擦拭，将电泳槽安装好，配制质量分数为12%的分离胶和质量分数为5%的浓缩胶。在配制过程中，不加入SDS，样品不需要加热变性。加入了电极缓冲液后，将样品（发酵液）用微量进样器点入点样孔底部，60 V电泳。当溴酚蓝到达分离胶时，电压改为150 V，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。将凝胶剥下，延泳道切成不同的小条块，分别浸泡在100 mL的不同的底物液（ABTS或胆红素）中，染色1～3 h，待胶带显色后立即照相。

1.2.5 还原糖的测定

将1 mL样品加入试管中，然后加入0.5 mL的 DNS，混匀放置沸水浴中水浴，5 min后取出加6 mL蒸馏水，混匀后于540 nm分光光度测量OD。

2 结果与分析

2.1 菌株IMER1在液体发酵中产BOX的时间曲线

菌株IMER1在液体发酵中产BOX的时间曲线如图1所示。

如图1所示，当培养了5 d左右时，菌株液体发酵产BOX酶量达到最大，酶量相对稳定，但是，随后缓慢下降。随着培养时间的增加，发酵液的颜色逐渐由灰色变成棕黄色，pH值从6.0上升到7左右。如图2所示，菌球随着时间的增加也逐渐变大，到后期慢慢开始溃解，最后大部分菌球会变成絮状，发酵液的黏度也会增加。上述结果表明，为了得到高酶活的BOX，应在发酵培养后的第5天左右收集滤液。如果在5 d之后去收集酶液，可能会对后续BOX酶的分离造成很大的影响。因为菌球的溃解会产生大量的杂蛋白，因此，在工业生产中，应该尽量避免在发酵后期收集酶液。

1.2.4 活性PAGE电泳

将玻璃板、胶垫和梳子用双蒸水洗干净，用酒精棉球擦拭，将电泳槽安装好，配制质量分数为12%的分离胶和质量分数为5%的浓缩胶。在配制过程中，不加入SDS，样品不需要加热变性。加入了电极缓冲液后，将样品（发酵液）用微量进样器点入点样孔底部，60 V电泳。当溴酚蓝到达分离胶时，电压改为150 V，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。将凝胶剥下，延泳道切成不同的小条块，分别浸泡在100 mL的不同的底物液（ABTS或胆红素）中，染色1～3 h，待胶带显色后立即照相。

1.2.5 还原糖的测定

将1 mL样品加入试管中，然后加入0.5 mL的 DNS，混匀放置沸水浴中水浴，5 min后取出加6 mL蒸馏水，混匀后于540 nm分光光度测量OD。

2 结果与分析

2.1 菌株IMER1在液体发酵中产BOX的时间曲线

菌株IMER1在液体发酵中产BOX的时间曲线如图1所示。

如图1所示，当培养了5 d左右时，菌株液体发酵产BOX酶量达到最大，酶量相对稳定，但是，随后缓慢下降。随着培养时间的增加，发酵液的颜色逐渐由灰色变成棕黄色，pH值从6.0上升到7左右。如图2所示，菌球随着时间的增加也逐渐变大，到后期慢慢开始溃解，最后大部分菌球会变成絮状，发酵液的黏度也会增加。上述结果表明，为了得到高酶活的BOX，应在发酵培养后的第5天左右收集滤液。如果在5 d之后去收集酶液，可能会对后续BOX酶的分离造成很大的影响。因为菌球的溃解会产生大量的杂蛋白，因此，在工业生产中，应该尽量避免在发酵后期收集酶液。

2.2 菌株IMER1在固体发酵中产酶的时间曲线

菌株IMER1在固体发酵中产酶的时间曲线如图3所示。

如图3所示，菌株IMER1固体发酵1 d后就可以测到BOX活性，而在液体发酵中，需要2 d后才能测到BOX活性。在第5天时，酶活达到最高，从第3天至第10天，酶活都处于较高的水平。这表明，菌株IMER1在麸皮固体基质中能持续高产BOX酶。随着培养时间的增加，BOX活性也会逐渐下降。将液体与固体发酵产酶作比较，从中可以看出，固体发酵产酶的时间早，保持高酶产量的时间长，同时，固体发酵产酶的成本比较低。虽然固体发酵要比液体发酵产酶的优势大，但是，大规模固体发酵也存在一些技术上的问题，比如设备占地面积大、劳动强度大、传质传热困难，参数比如pH值、温度、菌体增殖量和产物生成量等难检测。如果能有效地解决了这些问题，那么，固体发酵将会得到更好的发展。

2.3 菌株IMER1在液体和固体发酵中胞外酶的BOX活性检测

固体发酵粗酶液和液体发酵粗酶液活性电泳如图4所示。

漆斑菌属是产BOX的主要真菌，在工业中，常用该属菌株生产BOX，但是，也有报道表明，其他的氧化酶和BOX底物具有一定的交叉活性，比如漆酶。另外，该菌株在固体液体发酵中是否有差异，比如BOX同工酶的产生。为了进一步了解这些问题，可以对液体和固体发酵的胞外酶液进行活性电泳分析。理论上，BOX能催化黄色胆红素，形成一种绿色的物质，而其能催化无色的ABTS形成一种绿色物质。该实验利用BOX的底物（胆红素和ABTS）对IMER1的发酵液活性电泳后进行活性检测，使用胆红素溶液（pH8.0）底物显色的胶条时可以发现，在黄色的背景中，有明显的单条绿色条带，而使用无色的ABTS溶液底物（pH4.0）显色的胶条时可以发现，在灰色的背景中，有明显的单条绿色条带。实验结果说明，在液体和固体中发酵的粗酶液都能得到同样的现象。结果表明，IMER1在本文所述的条件下，在液体和固体中只产生1种BOX，没有同工酶，同时，菌株所产生的其他胞外酶不会与BOX产生交叉活性。

2.4 菌株IMER1宏观产BOX酶动力学

通过分析、比较可知酶的生产与细胞生长的关系，可以将酶生物合成的模式分为4种类型，即同步合成型、延续合成型、中期合成型和滞后合成型。

中期合成型是指酶的合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在进入细胞平衡期后，酶的合成也将终止。如图5所示，菌株IMER1在生长的调整期时（48 h内），发酵液中未检测到BOX酶活；进入对数生长期（48～119 h）后，BOX酶也开始合成，酶浓度逐步上升，而当菌株IMER1的生长达到平稳期后，BOX酶的浓度也达到平稳，即酶的合成停止。由于菌体在不断生长，培养基中还原糖的浓度（主要是葡萄糖）也在不断下降。在菌株IMER1的生长后期，还原糖浓度会降到最低，如图6所示。结果表明，菌株IMER1在PDB中的BOX酶分泌属于中期合成型。该类型酶的特点是其合成会受到反馈阻遏，而且其所对应的mRNA是不稳定的。如果在发酵培养的后期不断排空发酵液，并补充培养基，可以提高BOX酶的产率。

3 结论

当菌株IMER1在液体培养基中培养5 d左右时，其产BOX的活性最高，随后酶活性开始降低，同时，伴随着菌丝球溃解，因此，从液体发酵体系分离BOX的最适时间点为第5天，菌株IMER1在麸皮固体基质中发酵时能持续高产BOX酶。将液体发酵产酶与固体发酵产酶相比，固体发酵产酶的时间早，保持高酶产量的时间长，同时，固体发酵产酶的成本比较低。相比较而言，液体发酵液中酶的提取比从固体发酵物中提取要简单。因此，液体和固体发酵产BOX都有一定的优缺点。在液体和固体发酵物中，菌株IMER1不会产生BOX同工酶，其他胞外酶和BOX不会产生交叉活性。产酶动力学主要研究细胞产酶速率和各种因素对产酶速率的影响。研究群体细胞的产酶速率被称为宏观产酶动力学，属于非结构力学。宏观产酶动力学一般与细胞比生长速率和浓度以及产酶模式有关，可用式（1）表示：

. （1）

式（1）中：E为酶浓度，U/L；t为时间；?为比细胞生长速率，L/h；α为生长偶联的产酶系数，U/g，以细胞干重计；x为细胞浓度，g/L，以细胞干重计；β为非生长偶联的比产酶速率，U/g·h，以细胞干重计。

中期合成型的酶为特殊的生长耦联型，其非生长耦联比产酶速率β=0，所以，其宏观产酶动力学与同步合成型相同，产酶动力学方程可简化为：

. （2）

根据Monod方程式可知：

. （3）

式（3）中：μ为微生物的比增殖速度；μmax为微生物最大比增殖速度；S为限制性底物浓度，在该实验中指培养基中还原糖的浓度；KS为饱和常数，为μ=1/2μmax时的底物浓度。

将式（3）代入式（2）中，其产酶动力学方程为：

. （4）

在式（4）中，α，KS和μmax为模型参数，可利用线性化处理和尝试误差法求出有关模型参数值。根据α为生长偶联的产酶系数，以酶量为因变量，细胞干重为自变量，根据图5中的数据拟合曲线方程求出α=0.006 3；μmax为微生物最大比增殖速度，并求出其在产酶过程中的最大μ值，即μmax=4.022 56.根据（3）式求得KS=0.016 492.而模拟出的产酶动力学方程为：

. （5）

式（5）中：E为酶浓度，U/L；t为时间；S为PDB培养基中还原糖的浓度，g/L；x为细胞浓度，g/L。

由式（5）可知，单位时间的酶产量与PDB培养基中还原糖的浓度、菌体的浓度有关。分析菌株IMER1在液体和固体中产BOX酶的特征，其结果为提高BOX的产量打下了基础。

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〔编辑：白洁〕