甲泼尼松龙对多索茶碱在大鼠体内药动学的影响

王建美陈菲盛柳青叶其蓁

1.金华职业技术学院医学院药学部，浙江金华321000；2.温州医科大学附属第一医院药剂科，浙江温州325000

甲泼尼松龙对多索茶碱在大鼠体内药动学的影响

王建美1陈菲1盛柳青1叶其蓁2

1.金华职业技术学院医学院药学部，浙江金华321000；2.温州医科大学附属第一医院药剂科，浙江温州325000

目的考察单次尾静脉注射甲泼尼松龙对大鼠体内多索茶碱药动学的影响。方法将12只雄性大鼠随机分成多索茶碱组及合并用药组，用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定大鼠给药前后不同时间点多索茶碱的血清浓度，通过PK Solver 2.0软件拟合计算，对两组大鼠的多索茶碱主要药动学参数进行比较。结果两组大鼠多索茶碱AUC0～t、AUC0～∞、t1/2比较差异有统计学意义（P＜0.05），合并用药组较单独用药组均增加；而Cl_obs合并用药组较多索茶碱组减少。结论甲泼尼松龙可能对多索茶碱在大鼠体内的药动学有影响，会减慢其体内的代谢和消除。

甲泼尼松龙；多索茶碱；药动学；反相高效液相色谱法

多索茶碱是具有抗炎平喘作用的新一代甲基黄嘌呤的衍生物，通过抑制平滑肌细胞内的磷酸二酯酶达到扩张支气管、松弛平滑肌的作用，本品与茶碱和氨茶碱比较，具有疗效强、毒性较低的特点，临床上广泛用于治疗支气管哮喘、支气管炎、间质性肺炎等慢性阻塞性肺疾病[1-4]。糖皮质激素具有抗炎、抗过敏、抗休克、抗毒等药理作用，甲泼尼松龙作为人工合成的中效糖皮质激素，有较强的抗炎活性，并有较高的肺部浓度，能减轻慢性阻塞性肺疾病患者的急性炎症和气道阻塞。有文献报道，临床上联合使用两者能有效控制各种慢性阻塞性肺疾病的症状[5-7]。联合用药所致药动学变化的研究已成为合理用药的一个重要领域，多索茶碱是茶碱类药物，治疗窗比较窄，且影响其代谢的因素及药物较多，如张文颖等[8]研究了大鼠体内阿魏酸钠对多索茶碱的药动学影响，但关于甲泼尼松龙对多索茶碱药动学影响问题未见文献报道。鉴于此，本实验建立了一种同时测定甲泼尼松龙和多索茶碱浓度的反相高效液相色谱法，研究多索茶碱及其与甲泼尼松龙联用时大鼠体内药动学参数，为进一步研究甲泼尼松龙在人体内对多索茶碱的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

2487型HPLC仪（美国Waters公司，包括Breeze色谱工作站，2487紫外检测器，20μl自动进样阀）；SB30001电子天平；1004型分析电子天平；TDL80-2型离心沉淀器；WH-90A微型旋涡混合器；多索茶碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100625-201202）；甲泼尼松龙对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100828-200501）；氢化可的松对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100152-200206）；注射用多索茶碱（开封康诺药业有限公司，规格0.3 g，批号：D142823）；注射用甲泼尼龙琥珀酸钠（Pfizer Manufacturing Belgium NV，规格40 mg，批号：A06793）；甲醇、乙腈为色谱纯；水为重蒸馏水；其他试剂均为分析纯。

1.2 实验对象

健康雄性SD大鼠12只，清洁级，体重300～320 g，浙江省实验动物中心提供。大鼠随机分成多索茶碱组及甲泼尼松龙和多索茶碱联合用药组，每组6只。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件色谱柱为Diamonsil C18柱（150mm× 4.6mm，5μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸缓冲溶液（含1mol/L氢氧化钠，pH 3.8）（28∶72），检测波长为263 nm，柱温为30℃，进样量为20μl，流速为1.0 ml/min，内标物为氢化可的松。

1.3.2 标准曲线绘制精密称取内标氢化可的松10mg，加甲醇溶解并定容至10ml容量瓶，使成1.0 mg/m l的内标储备液。精密称取多索茶碱25 mg，用甲醇溶解并定容至25 ml容量瓶，使成1.0 mg/ml的标准储备液。放置于4℃冰箱中备用。

取多索茶碱标准储备液适量，置于加有定量内标氢化可的松和大鼠血清0.5 ml的离心管中，用甲醇配成浓度分别为50、25、12、6、3、1.5、0.8、0.4μg/ml的含药血清，涡旋混合1min，10 000 r/min离心10 min，静置20min，取上清液过滤，进样20μl[9]。

1.3.3 药动学实验多索茶碱组：多索茶碱用注射用氯化钠溶解，通过尾静脉单剂量一次注射多索茶碱50mg/kg。给药前取空白血，给药后按10、30、60、90、120、180、240、300、360 min眼眶取血约0.6 ml，37℃水浴中放置2 h后，于离心机中3000 r/min低温离心5min，吸取血清，将血清储存在－20℃待测。

合并用药组：甲泼尼松龙用自带的稀释液稀释。通过尾静脉同时给予甲泼尼松龙100 mg/kg和多索茶碱50 mg/kg，给药后按前述时间点从眼眶取血约0.6ml，按前述“多索茶碱组”方法处理样本，以测定各时间点多索茶碱的血药浓度。

1.3.4 数据处理药动学实验数据采用PK Solver 2.0药动学软件计算程序拟合，求出主要药动学参数，计量资料以±s表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

图1 空白血清色谱图

图2 空白血清+多索茶碱+内标氢化可的松+甲泼尼松龙色谱图

2.1 方法的专属性

按“1.3.1色谱条件”测定大鼠空白血清色谱图见图1；大鼠空白血清+多索茶碱+内标氢化可的松+甲泼尼松龙的色谱图见图2。多索茶碱、内标氢化可的松和甲泼尼松龙的保留时间分别为：3.974、12.846、21.607 min，三者峰型良好，分离完全，另外血清中的内源性物质对待测物出峰也不造成干扰。

2.2 标准曲线结果

对“1.3.2”配制的多索茶碱溶液进行高效液相色谱分析，相关图谱见图3，以测得多索茶碱峰面积与内标峰面积之比Y对血清药物浓度X（μg/ml）进行线性回归，重复测定5次，得多索茶碱的标准曲线方程为Y=0.0814X－0.0466（r=0.9997），线性范围为0.8～50μg/ml，最低检测浓度为0.4μg/ml。

图3 合并用药组给药后30 m in色谱图

2.3 回收率和精密度试验

取空白血清200μl，精密加入适量多索茶碱，制备成高中低三个浓度的多索茶碱标准血清样品（含多索茶碱分别为30、7.5、1μg/ml和20、5、0.5μg/ml），按“1.3.2”项下自“涡旋混合1 min”起处理后进行分析。在1 d之内连续测定5次计算日内精密度（用日内RSD表示），连续测定3 d计算日间精密度（用日间RSD表示），结果见表1。

表1 多索茶碱回收率与精密度试验结果（n=5）

2.4 药动学结果

采用非房室模型对两组大鼠的单次尾静脉注射多索茶碱50mg/kg后血药浓度数据进行处理，其中峰浓度和达峰时间采用实测值，两组的具体药动学参数见表2，平均血药浓度（n=6）的药时曲线见图4。与多索茶碱组比较，合并用药组半衰期（t1/2）、达峰浓度（Cmax）、AUC0～t、AUC0～∞上升，血浆清除率（Cl_obs）下降。两组的t1/2、AUC0～t、AUC0～∞比较差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 合用甲泼尼松龙前后多索茶碱药动学参数变化

图4 合用甲泼尼松龙前后多索茶碱平均血药浓度的药时曲线

3 讨论

实验设计的取血点是通过学习相关参考文献[10-14]，并进行预实验确定。在血清除蛋白方法建立实验过程中，选用过文献报道的三氯醋酸、高氯酸作为蛋白沉淀剂，以减少血清中待测物的稀释倍数，提高回收率。实验结果显示，上述方法血清内源性杂质对样品峰干扰大，检出面积小，降低了灵敏度，且不利于保护色谱柱。采用2倍体积的甲醇沉淀蛋白，方法简单，色谱峰峰型较好，回收率高且血清内源性物质不影响待测物和内标的测定。

《FDA药物相互作用研究指南（草案）》体内药物相互作用实验设计提出[15]，体内药物药动学研究通常采用比较药物浓度在有和没有合用药物时的变化情况。根据指南设计本实验，单次尾静脉注射多索茶碱组和同时注射甲泼尼松龙与多索茶碱组。比较两组药动学参数发现，多索茶碱的t1/2从单用药组的108.71min增加到175.09 min，AUC0～t从1359.22μg/（ml·min）增加到1771.86μg/（ml·min），Cmax略有上升，而Cl_obs则从3.33×10-2L/（min·kg）降低到1.95×10-2L/（min·kg）。笔者认为多索茶碱和甲泼尼松龙在肝药酶代谢上的相互作用可能是合并用药组多索茶碱t1/2明显延长、AUC0～t明显增加的原因。有研究表明，茶碱类药物的代谢酶主要为肝微粒体代谢酶CYP1A2[16-17]，肝药酶P450的活性受多种因素影响，如给药剂量、用药方式、药物剂型以及种族差异等因素。虽然未见甲泼尼松龙体内代谢情况的报道，但有文献报道[18]，大剂量皮质激素泼尼松的稳态血药浓度会对肝药酶P450产生抑制。本实验从甲泼尼松龙合并用药组AUC0～t的明显上升推测，甲泼尼松龙可能会对肝药酶产生影响。多索茶碱的药动学研究结果差异较大，多索茶碱药时曲线符合一室、二室模型的都有报道[19-20]，且药动学参数差异较大，本实验结果显示，甲泼尼松龙100mg剂量可能减慢多索茶碱的消除，也可能是多索茶碱在不同大鼠体内的个体差异引起。关于甲泼尼松龙对人体内多索茶碱药动学的影响需经进一步实验证实。

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Effect of methylprednisolone on the pharmacokinetics of doxofylline in rats

WANG Jian-mei1CHEN Fei1SHENG Liu-qing1YEQi-zhen2
1.Department of Pharmacy,School of Medicine,Jinhua College of Profession and Technology in Zhejiang Province,Jinhua 321000,China;2.Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital ofWenzhou Medical University in Zhejiang Province,Wenzhou 325000,China

Objective To study the effect of single dosemethylprednisolone on the pharmacokinetics of doxofylline in rats.M ethods Male ratswere randomly divided into doxophylline group and combined treatment group(doxophylline+ methylprednisolone).RP-HPLCmethod was adopted to determine the serum concentration for different time before and after administration of doxofylline.Pharmacokinetic parameterswere calculated by PK Solver 2.0 pharmacokinetics software.Pharmacokinetic parameterswere compared between two groups of rats.Results The two groups had statistical difference in ratswith AUC0～t,AUC0～∞,t1/2(P<0.05).The indexs of combined treatment group were increased than that of doxophylline group,Cl_obs group of combined treatment group was decreased compared with doxofylline group.Conclusion Methylprednisolone has influence on the pharmacokinetics of doxofylline in rats,will slow the body′smetabolism and elimination.

Methylprednisolone;Doxofylline;Pharmacokinetics;RP-HPLC

R969.1

A

1674-4721（2015）04（c）-0022-04

2015-02-28本文编辑：李亚聪）

浙江省医药卫生科技计划项目（2014KYA218）