萘降解菌的筛选及其对多环芳烃的降解

高 闯，张 全，王继锋

（1. 辽宁石油化工大学 石油化工学院，辽宁 抚顺 113001；2. 中国石化 抚顺石油化工研究院，辽宁 抚顺 113001）

萘降解菌的筛选及其对多环芳烃的降解

高 闯1，2，张 全2，王继锋2

（1. 辽宁石油化工大学 石油化工学院，辽宁 抚顺 113001；2. 中国石化 抚顺石油化工研究院，辽宁 抚顺 113001）

从柴油污染土壤中筛选分离出一株萘降解菌N-3，进行了菌种鉴定及萘双加氧酶基因（nah）验证，并考察了该菌对不同种类多环芳烃（PAHs）的降解能力及降解过程中脱氢酶活性的变化。实验结果表明：该菌为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），含有nah基因；当分别对液体培养基中质量浓度为50 mg/L的萘、菲、蒽、芘、芴降解84 h时，菌株N-3对萘、菲、蒽、芘、芴的降解率分别为28.81%，34.83%，36.65%，27.50%，23.47%。菌株N-3的脱氢酶活性与其对不同PAHs的降解率呈一定的正相关性。该菌不仅能有效降解萘，且对其他种类PAHs也有一定降解作用。

萘降解菌；多环芳烃；生物降解；菌种筛选；铜绿假单胞菌

多环芳烃（PAHs）是一类含有两个或两个以上苯环的芳香族化合物。近年来，随着人类生产活动的加剧，使环境中的PAHs大量增加［1］。由于PAHs具有疏水性强、相对分子质量高、稳定性好、毒性大、难降解、在环境中存在时间长［2］、具有潜在致癌性等特点［3］，被很多国家列为优先控制污染物［4-5］。土壤中的PAHs主要来源于污水灌溉、大气沉降和工业渗漏等。PAHs被土壤粒子吸附后，可经农作物富集而进入食物链，威胁人类健康［6］。此外，土壤中的PAHs还可进入大气和水体，造成二次污染。目前，微生物法是降解PAHs最有效的方法之一［7-8］。该法通过微生物的生长代谢等过程将有毒、难降解的有机物转化成无毒无害的化合物，安全经济且对环境无二次污染。近年来已有多名学者分离筛选出不同种类的萘、菲、蒽、芘、芴等PAHs的降解菌［9-14］。

本工作从柴油污染土壤中筛选、分离出一株高效萘降解菌N-3，对其进行了菌种鉴定及PCR扩增实验，并考察了该菌株对单一萘、菲、蒽、芘、芴的降解能力及降解过程中脱氢酶活性的变化。

1 实验部分

1.1 试剂、材料和仪器

萘、菲、蒽、芘、芴、氯化三苯基四氮唑（TTC）：纯度均为99%，Sigma-Aldrich公司；正己烷：分析纯；葡萄糖：纯度为97%。

Tris-HCl 缓冲溶液：三羟甲基氨基甲烷浓度为0.05 mol/L，pH=7.19。

土样：取自某市的柴油污染土壤。

LB 培养基：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH=7.0，121 ℃灭菌15 min，保存备用。

无机盐培养基：KH2PO41.0 g，K2HPO41.0 g，NH4NO31.0 g，MgSO40.5 g，CaCl20.01 g，FeSO4·7H2O 0.1 g，蒸馏水1 000 mL，pH=7.0，121 ℃灭菌15 min，保存备用。

萘选择性培养基及PAHs降解培养基：分别用正己烷配制萘、菲、蒽、芘、芴质量浓度为1 g/L的有机溶液，过滤除菌，取一定量添加到无机盐培养基中，使萘、菲、蒽、芘、芴的质量浓度分别为50 mg/L，待正己烷挥发完毕后备用。

在上述培养基中分别加入质量分数为2%的琼脂，即得相应的固体培养基。

6010型紫外-可见分光光度计：惠普公司；GC-2010型气相色谱仪：日本岛津公司。GTR21-1型离心机：北京时代北利公司。

1.2 萘降解菌的筛选

取10 g柴油污染土壤加入到100 mL无机盐培养基中，于温度30 ℃、转速170 r/min条件下浸取4 h，将浸取液在3 000 r/min下离心5 min，将10 mL上清液加入到100 mL萘选择性液体培养基中经4代富集培养（萘质量浓度从50 mg/L逐步提高到200 mg/ L）后，取适量富集培养液，稀释涂布在萘选择性固体培养基平板上，待有明显菌落出现时从中选取大小、形态各异的菌落在LB固体培养基上进行进一步划线纯化分离。

将各纯化后的菌株分别接种于LB液体培养基中，于温度30 ℃、转速170 r/min条件下摇床培养20 h，培养液在转速6 000 r/min下离心，用生理盐水重悬浮并调节菌悬液在600 nm处的吸光度（OD600）为1，冷藏备用。

将各菌悬液按10%（φ）的接种量分别接种到萘选择性液体培养基中，观察其生长情况并测定培养液中的萘含量，实验设置3组平行试样。

1.3 萘降解菌的鉴定

利用Baldwin等［15］2003年报道的nah基因的简并引物nahf/nahr，对筛选出的菌株进行PCR扩增实验，用细菌DNA提取试剂盒（Tiangen）对菌株进行DNA提取。选择一株生长情况最好、对萘降解能力最强且含有nah基因的菌株作为萘降解菌。

菌株的鉴定工作委托中美泰和生物技术（北京）有限公司完成。

1.4 萘、菲、蒽、芘、芴的降解

将萘降解菌的菌悬液按10%（φ）的接种量分别接种于100 mL 含不同PAHs的降解培养基中，于温度30 ℃、转速170 r/min条件下摇床培养，定时取样，测定菌体生长曲线及降解后培养液中各PAHs含量，实验设置3组平行试样。

1.5 分析方法

1.5.1 菌体浓度的测定

以菌体培养液的OD600值表征培养液中的菌体浓度。

1.5.2 萘、菲、蒽、芘、芴质量浓度的测定

试样经正己烷萃取后，用气相色谱仪测定各PAHs的质量浓度。色谱条件：进样口温度300 ℃，检测器温度330 ℃，毛细管柱50 m×0.25 mm×0.25 μm，柱温130 ℃保持3 min，以15 ℃/min的升温速率梯度升温至280 ℃，进样量1 μL。

1.5.3 脱氢酶活性的测定

通过测定微生物的脱氢酶活性可以了解微生物对有机污染物的氧化分解能力，具体方法见文献［16］：取2 mL降解后培养液于一系列具塞试管中，加入pH=8.5 的0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲溶液、0.1 mol/L 葡萄糖溶液、0.5%（w）TTC 各2 mL，置于30 ℃恒温培养箱中反应4 h。加入2滴浓硫酸中止反应，并准确加入5 mL甲苯，充分振荡，萃取。待反应生成的红色三苯基甲臜（TF） 被完全萃取到有机相时，将有机相在4 000 r/min下离心5 min，过滤后测定滤液于486 nm处的吸光度（OD486），以此表征萘降解菌的脱氢酶活性。

2 结果与讨论

2.1 萘降解菌的筛选

经过富集培养，在萘选择性固体培养基平板上得到3株能以萘为唯一碳源和能源生长的菌株，分别命名为N-1，N-2，N-3。3株菌在萘选择性培养基中的生长曲线见图1，降解60 h后3株菌的萘降解率见图2。由图1和图2可见，菌株N-3生长情况最好，且降解60 h后的萘降解率最高，达到25.31%。

图1 3株萘降解菌在萘选择性培养基中的生长曲线

图2 3株菌的萘降解率

3株菌的nah基因扩增电泳照片见图3。由图3可见，菌株N-1和N-3中均含有nah基因，而菌株N-2中未发现。结合图1～3的结果，以下实验选择N-3作为萘降解菌。

图3 3株菌的nah基因扩增电泳照片M：分子标记；NC：空白对照；N-1，N-2，N-3：萘降解菌

2.2 菌株N-3的鉴定

经过对菌株N-3的16S rDNA序列分析，鉴定其为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。对该菌进行简单生理生化实验，结果表明：该菌为革兰氏阴性菌，菌体的一端有单鞭毛，无芽胞；氧化酶阳性，能氧化分解葡萄糖和木糖，产酸不产气，但不分解乳糖和蔗糖，可液化明胶，可分解尿素，可还原硝酸盐为亚硝酸盐并产生氮气，吲哚试验呈阴性，可利用枸橼酸盐，精氨酸双水解酶阳性。

2.3 菌株N-3对萘、菲、蒽、芘、芴的降解

菌株N-3在不同PAHs体系中的生长曲线见图4。由图4可见：菌株N-3在萘、菲、蒽、芘、芴等5种PAHs中都能生长；在蒽和菲中生长情况最好，其次是萘，在芘和芴中生长情况最差。菌株N-3对不同PAHs的降解率见图5。由图5可见：经过84 h的降解，菌株N-3对萘、菲、蒽、芘、芴的降解率分别为28.81%，34.83%，36.65%，27.50%，23.47%；菌株N-3对这5种PAHs降解能力的大小顺序为：蒽＞菲＞萘＞芘＞芴，与该菌在不同PAHs体系中的生长情况呈一定的正相关性。实验结果表明，该菌不仅可有效降解萘，而且也能有效降解液相中其他种类的PAHs。

图4 菌株N-3在不同PAHs体系中的生长曲线

图5 菌株N-3对不同PAHs的降解率

2.4 菌株N-3的脱氢酶活性

菌株N-3在不同PAHs体系中的脱氢酶活性见图6。由图6可见：菌株N-3在所有PAHs体系中的OD486都是先增大后减小；在菲和蒽体系中，菌株N-3的脱氢酶活性在前72 h上升迅速，而后略有下降；在萘、芘和芴体系中，菌株N-3的脱氢酶活性在前60 h上升迅速，而后呈下降趋势，总体均低于菲和蒽体系中的脱氢酶活性。这表明该菌株对萘、芘和芴的降解能力没有对菲和蒽的降解能力强。该结果与菌株N-3对不同PAHs降解率的结果呈正相关性，由此也可证明用脱氢酶活性表征微生物对有机污染物的降解能力是一种可靠的方法。

图6 菌株N-3在不同PAHs体系中的脱氢酶活性

3 结论

a）从柴油污染土壤中分离出一株降解萘的菌株N-3。该菌能以萘为唯一碳源及能源生长，经鉴定为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），含有萘双加氧酶基因nah。

b）该菌能有效降解液相中的萘、菲、蒽、芘、芴。在质量浓度为50 mg/L的不同种单一PAHs体系中，经过84 h的降解，萘、菲、蒽、芘、芴的降解率分别为28.81%，34.83%，36.65%，27.50%，23.47%。

c）菌株N-3的脱氢酶活性与其对不同PAHs的降解率呈一定的正相关性，且对PAHs的降解具有广谱性。

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（编辑 叶晶菁）

Screening of Naphthalene-Degrading Strain and Degradation of PAHs

Gao Chuang1，2，Zhang Quan2，Wang Jifeng2
（ 1. College of Petrochemical Engineering，Liaoning Shihua University，Fushun Liaoning 113001，China；2. Sinopec Fushun Petrochemical Research Institute，Fushun Liaoning 113001，China）

A naphthalene-degrading strain N-3 was isolated and identified from the diesel-contaminated soil. The naphthalene dioxygenase（nah）gene in the cell was verified. The degradation abilities to different PAHs and the dehydrogenase activity of the strain were studied. The experimental results show that：N-3 is a Pseudomonas aeruginosa strain，containing nah gene；When naphthalene，phenanthrene，anthracene， pyrene or fluorene with 50 mg/L of mass concentration are degraded in the medium by N-3 for 84 h，their degradation rates are 28.81%，34.83%，36.65%，27.50% and 23.47%，respectively. There is a positive correlation between the dehydrogenase activity of N-3 and the degradation rates of different PAHs. The strain not only can degrade naphthalene effectively，but also can degrade other kinds of PAHs.

naphthalene-degrading bacteriun；polycyclic aromatic hydrocarbons；bio-degradation；strain screening；Pseudomonas aeruginosa

X172

A

1006 - 1878（2015）01 - 0017 - 04

2014 - 07 - 23；

2014 - 11 - 03。

高闯（1987—），男，辽宁省抚顺市人，硕士生，电话 18741390633，电邮 573088322@qq.com。联系人：王继锋，电话 18941366706。