替格瑞洛对大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增生的影响及机制研究*

魏 路 夏 勇 韩梦琪

(1.徐州医学院心研所，江苏徐州 221006； 2.徐州医学院附属医学院心内科，江苏徐州 221006；3.中国人民解放军97医院 ，江苏 徐州 221004)

替格瑞洛对大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增生的影响及机制研究*

魏 路1夏 勇2韩梦琪3

(1.徐州医学院心研所，江苏徐州 221006； 2.徐州医学院附属医学院心内科，江苏徐州 221006；3.中国人民解放军97医院 ，江苏 徐州 221004)

目的 研究抗血小板药替格瑞洛对大鼠颈总动脉损伤后内膜增生的影响及机制。方法 把42只普通SD大鼠用随机法分为正常对照组(6只)、球囊损伤组(12只)、替格瑞洛正常剂量组(12只)、替格瑞洛高剂量组(12只)。术后7天、21天取颈总动脉行H-E染色，观察颈总动脉病理形态变化，并测量内膜的面积(IA)和中膜的面积(MA)。免疫组化技术测定PDGF、PCNA的表达。结果 药物正常剂量和高剂量组与球囊损伤组比较，7天、21天内膜的面积、内膜/中膜的面积比明显减少(P<0.05)。颈总动脉的PDGF、PCNA的表达明显降低(P<0.05)。药物正常剂量组与药物高剂量组比较，7天时药物高剂量组的内膜面积、内膜/中膜的面积比明显减少(P<0.05)。颈总动脉的PDGF、PCNA的表达明显降低(P<0.05)。药物高剂量组与正常药物剂量组21天与7天的内膜面积差比较无明显差异。颈总动脉的PDGF、PCNA的表达无明显差异。结论 替格瑞洛能够减轻动脉损伤后内膜增生的程度，其可能机制为抑制血小板的活化，阻断血小板释放PDGF刺激血管平滑肌增生。球囊损伤前期高剂量药物组较正常剂量组抑制内膜增生较为明显，后期高剂量组与正常剂量组无明显差异。

替格瑞洛；球囊损伤；内膜增生；血小板源性生长因子

目前经皮冠状动脉成形术已广泛应用于三级医院，是临床上治疗冠状动脉粥样硬化的重要手段。近期疗效显著，但远期再狭窄问题持续受到广泛关注。替格瑞洛作为一线抗血小板药物，对于支架置入术后，支架内急性血栓形成有较好的抑制作用[1]。但是否对球囊损伤后的内膜增生具有抑制作用，鲜有报道。本实验通过制作大鼠颈总动脉球囊损伤模型，检测PDGF、PCNA的表达，试图阐明替格瑞洛对大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增生的影响及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 清洁级健康SD大鼠42只，体重250～300 g，购于徐州医学院实验动物中心。动物饲养条件：按清洁级大鼠饲养，每笼放养3只，实验室内光照、通风良好，按时定期消毒。

1.1.2 仪器及试剂 由美敦力公司提供的1.2 mm ×6 mm球囊，替格瑞洛采购于江苏无锡阿斯利康有限公司，PDGF-β抗体和PCNA 抗体采购于北京博奥森生物技术有限公司。超敏兔两步法检测(SP)试剂盒采购于北京中衫金桥生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及各组处理 将42只大鼠随机分为假损伤组(即对照组6只)、颈总动脉球囊损伤组(即模型组12只)、颈总动脉球囊损伤+替格瑞洛正常剂量(即正常剂量组12只)、颈总动脉球囊损伤+替格瑞洛高剂量(即高剂量组12只)。对照组：只进行颈总动脉的分离但不插入球囊损伤，术后每天给予等量生理盐水灌胃直至取标本。 损伤组：球囊损伤后给予等量生理盐水灌胃直至取标本。替格瑞洛正常剂量组：于造模前3天开始给予替格瑞洛每日两次剂量9 mg/ kg灌胃直至取出标本。替格瑞洛高剂量组：于造模前3天开始给予替格瑞洛每日两次剂量18 mg/ kg灌胃直至取出标本。对照组在7d、21 d处死3只大鼠并取出颈总动脉，其余各组分别在术后7 d、21 d处死6只大鼠并取出颈总动脉。

1.2.2 建立颈总动脉球囊损伤模型 腹腔注射10%水合氯醛(30 mg/ kg)麻醉大鼠后，充分暴露出左侧颈总动脉及左侧颈内、颈外动脉分叉处。于颈内、颈外动脉分叉处的远心端剪一V形切口。然后将1.2 mm×6 mm球囊插入颈总动脉内，送入距颈内、颈外动脉分叉处1 ～ 2 cm时，将压力泵加压至8个大气压并维持约10 s，缓慢回拉球囊至切口处，将压力泵回抽，使压力降为零。重复上述步骤3次，然后将球囊退出，结扎动脉，碘伏冲洗，逐层缝合皮下组织及皮肤。术后青霉素腹腔注射3天。

1.2.3 标本取材 分别于术后7 d、21 d 处死大鼠取材。用水合氯醛(30 mg/ kg)麻醉大鼠后，分离暴露出颈总动脉。取左颈总动脉约1～2 cm。PBS冲洗干净后，浸入10%甲醛中，于4℃冰箱固定24 h。

1.2.4 组织病理形态 将固定24 h后的标本取出，脱水、石蜡包埋。均匀切片(0.5 μm)，经HE染色后，在光镜下(×100)观察组织形态学变化及内膜增生情况。测量并计算血管内膜面积、内膜与中膜面积比和21天与7天的内膜面积差。

1.2.5 免疫组织化学 采用免疫组化SP法检测血小板源性生长因子(PDGF)及增殖细胞核抗原(PCNA)在颈总动脉中的表达。每段血管随机选取3张切片，在高倍光学显微镜(×400)下观察增殖情况，计算机分析图片，并计算出细胞阳性率。

2 结 果

2.1 病理形态学 在光镜下观察，对照组颈总动脉内膜光滑、平整，无内膜增生，弹力板完整。与对照组比较，损伤组7天时可见内膜弹力板的断裂，新生细胞排列紊乱、密集，内膜增生形成。21天时新生内膜增厚明显，除包含细胞成分外，还有大量的弹力纤维及细胞基质。药物组与损伤组对比，内膜增生程度较轻(见图1)。

2.2 内膜、中膜面积测量 通过测量发现，替格瑞洛能够有效的抑制血管内膜的增生，7天时替格瑞洛高剂量及正常剂量组较损伤组的内膜面积均有明显的减小(P<0.05)，并且高剂量组较正常剂量组亦有明显减小(P<0.05)。21天时替格瑞洛高剂量组及正常剂量组较损伤组的内膜面积均有明显的减小(P<0.05)，但高剂量组的面积差与正常剂量组的面积差比较无明显差异(面积差IA21-7=21天的内膜面积-7天的内膜面积)(见表1)。

2.3 损伤血管中PDGF的表达 7天时高剂量组及正常剂量组较损伤组的PDGF的表达明显减少(P<0.05)。高剂量组较低剂量组的PDGF表达明显减少(P<0.05)。21天时高剂量组及正常剂量组较损伤组的PDGF的表达明显减少(P<0.05)，但高剂量组较低剂量组的PDGF表达无明显差异(P>0.05)(见图2，表1)。

2.4 损伤血管中PCNA的表达 7天时高剂量组及正常剂量组较损伤组的PCNA的表达明显减少(P<0.05)。高剂量组较低剂量组的PCNA表达明显减少(P<0.05)。21天时高剂量组及正常剂量组较损伤组的PCNA的表达明显减少(P<0.05)，但高剂量组较低剂量组的PCNA表达无明显差异(P>0.05)(见图3，表1)。

表1 各组内膜面积(IA)、内膜/中膜(IA/MA)及21天与7天内膜差(IA21-7)和PCNA、PDGF的免疫组化阳性细胞率

注：与对应时间的模型组比较，*P<0.05；与对应时间的模型组比较，#P<0.05；与对应时间的模型组比较，**P<0.05；与对应时间的模型组比较，ΔP<0.05。

图1 7d、21d 各组颈总动脉新生内膜增生情况(×100)

图2 7d、21d各组PDGF免疫组化表达情况(×400)

1. 7天对照组；2.7天模型组；3.7天正常剂量组；4.7天高剂量组；5.21天对照组； 6.21天模型组； 7. 21正常剂量组； 8.21天高剂量组

图3 7d、21d各组PDGF免疫组化表达情况(×400)

3 讨 论

经皮冠状动脉成形术后再狭窄是临床一直关注的问题，其形成机制普遍认为与内膜的增生、平滑肌的增生和迁移、炎症反应及血管内凝血和血栓的形成等有关[2-3]。其中内膜的增生和血管平滑肌的增生及迁移被认为是血管内再狭窄的重要机制。

球囊损伤血管内皮后，内皮下组织暴露，内弹力板断裂，血小板激活并聚集于损伤处，导致局部血栓形成。激活的血小板、损伤的血管内皮细胞及合成型的平滑肌细胞都能通过自分泌、旁分泌的形式释放大量的PDGF，PDGF通过与细胞膜上相应的PDGF受体结合[4]，促进血管平滑肌细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞的增殖，同时促进血管平滑肌细胞的迁移，单核巨噬细胞、平滑肌细胞内吞脂质形成泡沫细胞。替格瑞洛(Ticagrelor)是一种新型的口服的抗血小板药物，通过可逆转性阻断血小板P2Y12受体，能够强效抑制血小板聚集、活化[5]，进而抑制血小板释放PDGF。PDGF能刺激多种细胞的分裂增生如血管平滑肌细胞、成纤维细胞、胶质细胞。并通过刺激胶原纤维的合成和激活胶原酶的作用调节细胞外基质的更新，最终促进平滑肌的细胞裂解、增殖[6]。本实验结果显示替格瑞洛药物组能够明显的减少损伤后PDGF的生成，进而抑制球囊损伤后内膜的增生。

增殖细胞核抗原(PCNA)是DNA多聚酶δ的辅助蛋白，在DNA复制时诱导DNA链的延长，PCNA是细胞进入并通过S期所必需的。主要在G1晚期、S期表达，可以作为细胞增殖程度的指标，其表达水平的高低与细胞增殖的程度成正相关，表达的阳性细胞数越多说明血管平滑肌增殖越强，静止期的非增殖状态细胞表达少[7]。通过测定PCNA阳性细胞数，我们可以间接得出血管平滑肌的增生情况。实验中我们通过测定PCNA的阳性细胞数，发现球囊损伤组的PCNA阳性数明显高于药物干预组，说明替格瑞洛能够有效的抑制PCNA的表达。

已有文献报道，大鼠血管内皮损伤后3天血小板活性较对照组明显增高，7天达峰值后开始下降。表明血管内皮损伤后体内血小板即刻开始活化，并且至少在l周内处于活化状态，释放大量PDGF[8]。PCNA是目前评价细胞增殖状态比较可靠的指标，从动脉血管损伤后的增生过程看，PCNA表达的阳性细胞率在术后1周左右达到高峰，以后随时间推移逐渐下降。本实验亦发现高剂量组在7天时较正常剂量组抑制血管狭窄的作用显著，而在21天时两组无统计学差异，可能与高剂量组早期抑制血小板活化的作用较强，抑制了大量的PDGF释放，进而抑制血管平滑肌的增殖和迁移等有关。

目前临床上已广泛应用替格瑞洛预防支架内急性血栓形成，取得了很大成功，本实验通过大鼠颈总动脉损伤术后，证明替格瑞洛具有抑制血管的再狭窄，并且早期高剂量应用有较明显的抑制再狭窄作用。但动物模型与人体真实反应仍有差异，是否能够直接应用于临床，有待于进一步研究。

[2] 韦立新．经皮腔内冠状动脉成形术后再狭窄的病理学机制[J]．中国动脉硬化杂志，2000，8(1)：1-3

[3] Koseoglu K, Akar H, Eraslan C，et al．Color Doppler US evaluation of feeding artery after balloon angioplasty of the drainage vein in dysfunctional hemodialysis AVF[J]．Ren Fail，2008，30(8)：801.

[4] 王云雅，汪静，邓敬兰，等.放射性PDGFR反义寡核苷酸对血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响[J].心脏杂志,2006,18(4):388-390.

[5] Abergel E, Nikolsky E. Ticagrelor: an investigational oral antiplatelet treatment for reduction of major adverse cardiac events in patients with acute coronary syndrome[J].Vasc Health Risk Manag，2010,6:963-977.

[6] Keramati AR，Singh R，Lill A，et al．Wild-type LRP6 inhibits，whereas. atherosclerosis-linked LRP6R6llC increases PDGF-dependent vascular smooth muscle cell proliferation [J ]．proc Natl Acad Sci LSA，20ll，108(5)：1914-1918．

[7] 焦延景,邱龄,肖传实,等. 大鼠颈动脉球囊损伤后血管平滑肌细胞增生性衰老的实验研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2008,6(9):1055-1056.

[8] 李永红，葛志明，李志强，等. 球囊损伤大鼠主动脉内皮后血小板活化及凝血酶受体表达的变化[J].2005,13(3):325-326.

Effect and mechanism of ticagrelor on carotid artery intimal hyperplasia in rats after balloon injury

WEI Lu XIA Yong HAN Meng-qi

(1. The Cardiovascular Institute of Xuzhou Medical College， Xuzhou 221006， China;2. Dept. of Cardiology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College， Xuzhou 221006， China;3.97 People's Liberation Army Hospital, Xuzhou 221004, China)

Objective: To investigate the effect of anti-platelet drug ticagrelor on carotid artery intimal hyperplasia in rats after balloon injury and its mechanism. Methods：Forty-two ordinary SD rats were randomly divided into normal control group (n=6), balloon injury group (n=12), ticagrelor normal dose group (n=12), ticagrelor high-dose group (n=12). Carotid artery of four groups was taken out at 7 days and 21 days after balloon injury. The pathological changes of carotid artery was observed by H-E staining and intimal area (IA) and the membrane area (MA) was measured. PDGF and PCNA expressions were determined by immunohistochemical method. Results：Compared with the balloon injury group, the intimal area and the intima / media area ratio was significantly reduced in the high dose group and normal dose group (P<0.05). Carotid artery PDGF and PCNA expressions were significantly lower (P<0.05). Compared with the normal dose groups, at 7 day points intimal area and the intima / media area ratio were significantly reduced in high dose group(P<0.05). Carotid artery PDGF amd PCNA expressions were significantly lower, too(P<0.05). High-dose group and normal drug dose group showed no significant difference in the intimal area between 21 days and 7 days. At the same time, there was no significant difference in the expression of the common carotid artery PDGF and PCNA. Conclusion：Ticagrelor can reduce the extent of intimal hyperplasia after arterial injury and its mechanism probably includes inhibition of platelet activation, blocking platelet release PDGF stimulating vascular smooth muscle proliferation. Early balloon injury has more obvious inhibition of intimal hyperplasia in the high dose drug group than in the normal dose group, and at the later stage high dose group has no difference from the normal dose group.

ticagrelor；balloon injury；restenosis；platelet-derived growth factor

魏路 (1987-)，男，江苏徐州人，在读硕士研究生，从事于冠心病的发病机制研究。

夏勇，E-mail：zbc316@163.com。

R541

A

1004-7115(2015)03-0247-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.03.003

2014-10-27)