慢性乙型肝炎患者呼出气体的电喷雾萃取电离质谱分析

王海东等

摘 要 应用电喷雾萃取电离质谱法对慢性乙型肝炎患者（41例）及正常人（34例）的呼出气体样本进行检测，迅速获得其一级质谱指纹谱图，采用化学计量学方法主成分分析（PCA）和聚类分析（CA）对所获得的一级质谱数据进行处理后，可有效区分患者与正常人群，且不同临床类型慢性乙肝聚类分析图谱有不同表现，此结果有助于慢性乙型肝炎的临床诊断和病情分析。另外，本方法也为发展简单、快速、非侵入性慢性乙型肝炎临床诊断方法提供解决思路。

关键词 慢性乙型肝炎； 呼出气体； 电喷雾萃取电离质谱； 主成分分析； 聚类分析

1 引 言

肝脏是人体内最大的消化腺，也是体内解毒和新陈代谢的中心。肝脏疾病有着高发病率和死亡率，病因复杂多样，临床可表现从无症状至严重的肝功能衰竭[1]。临床医师很早就发现，肝昏迷的患者呼出气中就有一种肝臭气味。随着现代科学技术的发展，特别是分析化学和质谱技术的发展，呼出气体检测作为一种了解人体生理代谢过程和疾病状况的方法备受关注[2，3]。呼出气与常规的血液检测方法相比，检测的最大优点是采样简单，具有非侵入性，且样本连续可得[4]。目前，对呼出气研究多集中在肺部疾病和环境气体，肝病的呼出气研究鲜有报道。

常规的呼出气检测质谱方法为气相色谱质谱联用（GCMS）法，而此方法需经过复杂的前处理及色谱分离过程，难以满足临床诊断的快速分析。电喷雾萃取电离质谱（EESIMS）是一种新型的直接质谱分析方法，可在无需样品预处理条件下对复杂基体样品进行直接、快速、灵敏、高通量质谱检测[5，6]。与其它质谱技术相比较，EESIMS可直接检测患者呼出气体，且灵敏度高、响应速度快，能够实现呼出气体中的痕量有机物的原位、实时、在线的分析[6＼] 。

本研究利用电喷雾萃取电离质谱（EESIMS）技术对41例慢性乙型肝炎患者呼出气进行了初步分析，结合化学计量学对所获得的指纹图谱对数据进行处理，结果表明，EESIMS结合化学计量学算法仅依靠一级谱图即可对慢性乙型肝炎患者及正常人的呼出气体样本进行较好区分，故而对疾病的诊断和病情的判断均有一定的临床意义。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

EESI 离子源[7，8]（东华理工大学研制）；LTQXL 增强型线性离子阱质谱仪（美国Finnigan 公司），配有Xcalibur 数据系统；T2PV/L 型 5L Tedlar采样袋（大连德霖气体包装有限公司）；甲醇（色谱纯，SK Chemicals 公司）。

2.2 实验方法

Tedlar采样袋在使用前用氮气清洗3次，每次30 min， 烘干以除去可能残留的吸附物。受试者夜间禁食、禁烟、禁酒，晨起后勿刷牙，在通风条件良好的环境下呼吸30 min以上，在安静状态下向5LTedlar采样袋内呼气，直至气袋充满为止，同时收集周围空气作为实验背景空白。呼气样本收集完毕后利用EESIMS在3 h内完成所有样本的检测分析。

2.3 实验条件

EESIMS分析条件：EESI离子源角度（α，β）和距离（a，b）根据以往文献＼[7，8＼]优化调节，质谱采用正离子检测模式，雾化气（N2）压力为1.2 MPa；进样口温度为100℃，扫描质量范围50～800 Da；喷雾电压为3. 5 kV；萃取剂甲醇溶液流速为5 μL/min。

3 结果与讨论

3.1 41例慢性乙型肝炎患者与正常人呼出气体的质谱分析

采用正离子扫描模式，在优化的EESIMS条件下对肝病患者和健康对照组呼出气体样本进行快速质谱分析，可以得到其一级质谱指纹谱图（图1）。从图1可知，41例患者同对照组呼出气体样本在m/z 50～400范围内具有丰富的物质信息，表明EESIMS能够同时检测到呼出气体中的多种组分。虽然质谱图在m/z>400处的质谱信号相对较低，但将指纹图谱放大20倍后仍可获得信噪比较高（S/N>10）的质谱。由于呼出气体中的挥发性标志物含量都较低，所以在一级质谱图中患者与正常人的主要质谱峰基本相同。但是，仔细观测这些质谱峰信号后可以发现仍然差别，主要体现在m/z 56， 74， 89， 105， 157， 201， 279， 318等质谱信号。为了更好地区分患者与正常人的呼出气体的差异，本研究采用化学计量学方法对质谱信号进行统计学处理。

3.3 慢性乙肝不同临床类型患者的聚类分析

聚类分析（CA）是一种静态数据分析的统计学方法，它能够将子集之间更细微的区别与联系以谱系图的方式直观地表现出来，目前已广泛应用于模式识别和图像分析等领域[17]。本实验将已进行过PCA分析的慢性乙型肝炎患者与正常人呼出气体样本一级质谱数据导入Matlab软件自带的聚类分析程序中进行分析，分析结果如图4所示。慢性乙肝患者呼出气体样本为41个，正常人呼出气体样本为34个，从分析结果可知，1～102号样本点（正常人的呼出气体）经软件程序分析后自聚成一类，103～225号样本点（慢性乙型肝炎患者的呼出气体）自聚成另一类，从而说明聚类分析能够明显的对慢性乙型肝炎患者及正常人的呼出气体样本进行区分，这与PCA 的分析结果相印证。而在慢性乙型肝炎患者呼出气体样本中，又可明显看到其一大类中又自聚成4个亚类，分析其可能原因为，103～171号样本点的23例患者为慢性重型或重度肝炎，病情重，病情进展较快，并发症较多，短期内发展成为肝衰竭；172～189号样本点的6例患者诊断为肝硬化，病程长至数月，患者就诊时多已出现腹水，处于肝硬化失代偿期；190～204号的5例患者来说起病较缓，病情相对较轻，结合生化检查诊断为慢性中度乙型病毒性肝炎；205～225号的7例患者为慢性轻度乙型病毒性肝炎，临床表现为食欲下降，睡眠不佳等，症状不明显，生化检查仅1～2项轻度异常；从慢性乙型肝炎的不同类型之间，因为肝脏的损伤程度不同，而对所测到的物质的代谢也有区别，表现形式不同，符合慢性乙型肝炎的病理生理过程。因此可能成为它们自聚成一类的原因；而本实验在PCA分析中未发现此差异，说明CA分析能够直观地表现出子集之间更细微的差别与联系。

4 结 论

综上所述，利用EESIMS对慢性乙型肝炎患者及正常人呼出气体样本进行直接质谱分析，获得其一级质谱指纹谱图，结合化学计量学中主成分分析法（PCA）和聚类分析法（CA）对所获得的指纹图谱数据进行处理，仅一级谱图即可将慢性乙型肝炎患者及正常人的呼出气体样本快速、灵敏、准确地区分开来，且对于临床不同类型慢性乙型肝炎轻和重也有区别。这个结果对于慢性乙型肝炎的临床诊断和病情分析有一定的帮助，此方法也为简单、快速、非侵入性临床诊断方法的开发提供一种思路。但本研究样本量较少，部分区别的物质还未能确定，还需进一步深入的研究。

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