芝麻素抗哮喘炎症作用研究

李良昌，朴红梅，延光海，秦向征，李光昭

(1.延边大学医学院解剖学教研室, 吉林 延吉 133002；2.延边大学附属医院呼吸内科, 吉林 延吉 133000)

芝麻素抗哮喘炎症作用研究

李良昌1，朴红梅2，延光海1，秦向征1，李光昭1

(1.延边大学医学院解剖学教研室, 吉林 延吉 133002；2.延边大学附属医院呼吸内科, 吉林 延吉 133000)

目的 观察芝麻素抗哮喘作用，并探讨其可能的作用机制。方法 40只♂清洁级BALB/c小鼠，随机分为正常组、哮喘组、芝麻素低剂量组、芝麻素高剂量组和地塞米松组。体外卵清蛋白(OVA)诱导建立哮喘模型，ELISA和Western blot方法检测芝麻素对支气管炎肺泡灌洗液(BALF)和肺组织白细胞介素- 4、5、13(IL-4、5、13)、干扰素-γ(IFN-γ)表达的影响。HE染色观察肺部炎症变化，Western blot方法检测IκBα磷酸化和NF-κB活化。结果 哮喘组与正常组相比，炎症细胞计数、IL-4、IL-5、IL-13水平增高，而IFN-γ的表达明显降低(P<0.05)，IκBα磷酸化和NF-κB核转位明显增加(P<0.05)；芝麻素高剂量组明显降低炎症细胞计数、IL-4、IL-5、IL-13水平，提高IFN-γ的表达(P<0.05)，同时抑制IκBα磷酸化和NF-κB核转位(P<0.05)。结论 芝麻素通过抑制NF-κB激活，减轻哮喘炎症反应。

哮喘；芝麻素；气道炎症；NF-κB；白介素4；白介素5；干扰素-γ

支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞等多种炎症细胞参与的慢性气道炎症性疾病[1]。糖皮质激素是治疗哮喘的一线药物，但长期使用可引起耐药性和严重的副反应。因此，有必要研究哮喘的发病机制，寻求新的治疗哮喘的靶点。芝麻素从芝麻中提取，在体内表现出较强的生物学活性，其药物作用近年逐渐被人们所重视。研究表明，芝麻素通过抑制p38磷酸化和NF-κB激活，抑制IL-6释放[2]，通过p38和JNK信号途径降低MMP-1，3和13的表达[3]，也可以通过降低VCAM-1表达抑制白细胞迁移，改善器官炎症[4]，对血管内皮有明显的保护作用[5]，表明芝麻素有明显的抗炎作用，但芝麻素抗哮喘作用研究却未见报道。本研究利用哮喘动物模型观察芝麻素抗哮喘作用，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂卵清蛋白 (OVA)、氢氧化铝购自美国Sigma公司；细胞因子 IL-4、IL-5、IL-13 和 IFN-γ 检测试剂盒购自美国Invitrogen公司;IL-4、IL-5、IL-13 和IFN-γ多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；IκBα、NF-κB p65 和β-actin购自美国Cell Signaling公司。雾化器(上海四菱医疗器械厂402型超声雾化器)；酶联免疫检测仪 (RT-2100C，美国)；电泳仪及电泳槽 (E-C Apparatus Corporation，美国)；Western blot转膜仪和Gel Doc凝胶成像仪(BioRad公司)。

1.2 哮喘模型的建立和动物分组♂ BALB/c 小鼠 40只，体质量(18±5)g，由延边大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(吉)2003-000。小鼠随机分成5组，每组 8 只。正常组(Normal)、哮喘组(OVA)、芝麻素低、高剂量组(Sesamin 50、100 mg·kg-1)、阳性对照地塞米松组(DXM)。除正常组外，其余各组分别于d 1、d 14给小鼠腹腔注射2% OVA和氢氧化铝混合溶液 0.2 mL致敏。d 21将致敏小鼠置于玻璃罩内，以1% 生理盐水 OVA 溶液15 mL雾化激发 30 min，每天1次，共 5 d。芝麻素低、高剂量组分别在激发前灌服芝麻素50、100 mg·kg-1，地塞米松组按0.5 mg·kg-1灌服地塞米松。共计6 d。

1.3 实验样本获取与处理末次激发 24 h 后处死小鼠，以磷酸盐缓冲液1 mL行支气管肺泡灌洗，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。用细胞计数板计数细胞总数。然后4℃、3 000 r·min-1离心 10 min，取上清液， -80℃ 低温保存，待测细胞因子。沉淀涂片，Diff-Quik染色，高倍镜下进行细胞分类计数。取右肺下叶，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋后切片，进行HE染色。其余各肺叶放入液氮中速冻，-80℃保存。

1.4 BALF中细胞因子IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ含量的检测采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定，具体操作按试剂盒说明书进行，结果单位以pg·L-1表示。

1.5 免疫印迹参照延光海等[6]方法，取 200 mg 肺组织置入裂解液 0.5 mL匀浆，4℃ 12 000×g离心 2 min，取上清液,BCA法测定蛋白浓度，取30 μg蛋白，经12%SDS-PAGE电泳，120 V，90 min，然后电转移至PVDF膜上，在5%脱脂奶粉TBS-T缓冲液(25 mmol·L-1Tris, 150 mmol·L-1NaCl, 1% Tween 20, pH 7.5)室温下封闭2 h，分别加入一抗4℃过夜，洗膜后再用 HRP标记的二抗杂交，37℃ 1 h。洗膜后，在暗室中加ECL发光试剂，显影及定影。杂交信号在图像分析系统中进行光密度扫描。以β-actin 作为内参对照。

2 结果

2.1 BALF中炎症细胞的变化与正常组比较，哮喘组BALF中炎症细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞计数明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；芝麻素高剂量组和地塞米松组明显降低哮喘小鼠BALF中上述细胞数量，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，单核细胞在各组无明显变化(Tab 1、Fig 1)。

Fig 1 Effect of sesamin on total and differential cellular components count in BALF of asthma model ±s，n=8)

#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsOVA

2.2 芝麻素对BALF中细胞因子IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ浓度的影响哮喘组BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平升高，而IFN-γ水平降低，与正常组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；芝麻素高剂量组和地塞米松组能明显降低哮喘小鼠BALF中细胞因子IL-4、IL-5、IL-13水平，并提高IFN-γ水平，差异均有统计学意义(P<0.05)(Tab 2、Fig 2)。

2.3 芝麻素对肺组织的病理学改变的影响HE染色结果显示，正常组气道无明显改变; 模型组气道壁变粗，气道平滑肌增厚，炎症细胞浸润比较明显，多层的炎症细胞围绕在气管和血管周围，黏膜下层增生；芝麻素高剂量组和地塞米松组能明显减轻哮喘病理改变(Fig 3)。

Tab 1 Effect of sesamin on total and differential cellular components count in BALF of asthma model mice ±s, n=8，×105 ·ml-1)

#P<0.05vsnormal；*P<0.05vsOVA

GroupDose/mg·kg-1IL-4IL-5IL-13IFN-γNormal-80.23±8.5872.56±9.5738.98±7.5675.23±4.56OVA-298.23±12.56#458.60±18.35#85.69±6.35#25.36±2.34#Sesamin50254.35±10.58426.28±16.2489.34±7.8323.21±3.24Sesamin100178.69±10.56*278.69±15.67*65.78±7.25*42.38±4.69*DXM0.5123.89±9.85*152.78±10.89*45.67±8.13*68.54±5.23*

#P<0.05vsnormal；*P<0.05vsOVA

Fig 2 Effect of sesamin on levels of IL-4,IL-5,IL-13 and

#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsOVA

2.4 芝麻素对肺组织IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ蛋白表达水平的影响哮喘组肺组织IL-4、IL-5和IL-13蛋白表达明显增高，但IFN-γ蛋白表达明显降低，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)；芝麻素高剂量组和地塞米松组IL-4、IL-5和IL-13蛋白表达明显降低，但IFN-γ蛋白表达明显升高，与哮喘组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见Fig 4。

2.5 芝麻素对肺组织IκBα蛋白磷酸化的影响哮喘组肺组织的磷酸化IκBα蛋白表达高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；与哮喘组比较，芝麻素高剂量组和地塞米松组磷酸化IκBα蛋白明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，总IκBα蛋白变化与磷酸化刚好相反(Fig 5)。表明芝麻素能明显抑制哮喘小鼠IκBα磷酸化和IκBα的降解。

Fig 3 Effect of sesamin on pathologic changes in lung tissues of asthma model mice(HE staining, bar=50 μm)

Fig 4 Effect of sesamin on protein production of cytokines (IL-4,IL-5,IL-13 and IFN-γ) in lung tissue of

A:Western blot;B：Relative density.#P<0.05vsnormal；*P<0.05vsOVA.

Fig 5 Effect of sesamin on IκBα phosphorylation in

A:Western blot，B：Relative density.#P<0.05vsnormal；*P<0.05vsOVA.

2.6 芝麻素对NF-κB活化的影响哮喘组细胞核内NF-κB p65明显增加，但胞质中NF-κB p65明显减少，与正常组比较有统计学意义(P<0.05)。芝麻素高剂量组和地塞米松组细胞核内NF-κB p65减少，而胞质中NF-κB p65明显增加，与模型组比较有统计学意义(P<0.05)。说明芝麻素有效减少NF-κB核转位，抑制NF-κB活化(Fig 6)。

3 讨论

支气管哮喘是一种气道和肺部慢性炎症性疾病，浸润的炎症细胞主要以嗜酸性粒细胞为主，也包括肥大细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等。这些细胞释放多种细胞因子，如Th1细胞因子IFN-γ和Th2细胞因子IL-4、IL-5 和IL-13等，Th1和Th2细胞因子表达的变化直接影响哮喘的发病。研究表明，芝麻素有明显的抗炎作用。芝麻素通过抑制Δ5脂肪酸去饱和酶活性，降低炎症介质前列腺素E2和TNF-α。在LPS诱导的炎症休克小鼠中，芝麻素能明显降低IL-1β、前列腺素E2和血栓素B2水平，提高IL-6和IL-10的表达，从而提高小鼠的存活率[8]。本实验研究显示，芝麻素能明显降低哮喘小鼠BALF中细胞总数和包括嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数量；减少哮喘小鼠BALF和肺组织中 IL-4 、IL-5 和IL-13水平，提高IFN-γ的表达；HE染色也显示芝麻素减轻哮喘小鼠肺部炎症细胞浸润。芝麻素能明显降低Th2代表细胞因子水平，提高Th1代表细胞因子的水平，并能明显抑制哮喘小鼠肺部炎症，提示芝麻素有明显的抗哮喘炎症作用。

Fig 6 Effect of sesamin on NF-κB activation in lung tissue of asthma model ±s,n=8)

A:Western blot;B：Relative density.#P<0.05vsnormal；*P<0.05vsOVA.

哮喘炎症与复杂信号网络转导有关，有关哮喘的发病机制仍然不清楚。NF-κB是一个核转录因子，与包括哮喘等免疫和炎症反应密切相关[9-10]。正常NF-κB与NF-κB抑制蛋白IκBα结合并稳定的存在于细胞质中，当细胞激活后，IκBα发生磷酸化并降解， NF-κB和IκBα复合体解离，暴露NF-κB核定位序列，NF-κB进入细胞核内与目的基因特异性结合位点结合，促进包括IL-4、IL-5 和IL-13等目的基因的转录。Jeng等[2]研究发现，芝麻素通过抑制p38和NF-κB活化减低BV-2细胞IL-6 mRNA和蛋白的表达。Harikumar等[11]也发现芝麻素通过NF-κB调节KBM-5等多种肿瘤细胞存活、增殖和侵袭。Cui等[12]通过体内和体外实验证明了芝麻素通过ERK1/2和NF-κB信号途径抑制细菌趋化肽诱导的炎症反应，提示NF-κB可能是芝麻素潜在的作用靶点。本实验显示，哮喘小鼠IκBα磷酸化明显增加，总IκBα明显减少，同时细胞质NF-κB p65减少，细胞核内NF-κB p65增多，引起NF-κB核转位。芝麻素能明显抑制IκBα磷酸化，增加总IκBα的表达，同时增加细胞质NF-κB p65，减少细胞核内NF-κB p65，表明芝麻素能够抑制IκBα磷酸化并减少其降解，阻止NF-κB p65与IκBα解离，抑制NF-κB核转位。综上所述，芝麻素有明显的抗哮喘作用，其作用机制部分是通过调节NF-κB激活。

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Sesamin attenuates inflammation response in a murine model of asthma

LI Liang-chang1, PIAO Hong-mei2, YAN Guang-hai1, QIN Xiang-zheng1, LI Guang-zhao1

(1.DeptofAnatomyandHistologyandEmbryology,YanbianUniversityMedicalCollege,YanjiJilin133002,China; 2.DeptofRespiratoryMedicine,YanbianUniversity,YanjiJilin133000,China)

Aim To investigate the effects of sesamin on inflammation response of asthma and to explore its possible mechanism of action. Methods Forty male BALB/c mice were randomly divided into five groups with 8 mice in each group: normal group, ovalbumin (OVA) group, sesamin low dose group, sesamin high dose group and dexamethasone(DXM) group. Asthma model mice were induced by OVAinvivo. The left lung was isolated for pathological examination. Experiment of ELISA and Western blot were used to determine the effect of sesamin on IL-4,IL-5,IL-13 and IFN-γ expression. Hematoxylin and eosin stain was used to investigate pathological examination in lung tissue. Western blot was performed to detect the IκBα phosphorylation and NF-κB nuclear translocation. Results The mice developed the following pathophysiological features of asthma: increased numbers of inflammatory cells, increased levels of IL-4, IL-5 and IL-13, decreased level of IFN-γ in bronchoalveolar lavage fluids(BALF) and lung tissues(P<0.05), and increased IκBα phosphorylation and NF-κB nuclear translocation in lung tissues(P<0.05). Administration of sesamin markedly reduced airway inflammatory cell recruitment, reduced the production of IL-4, IL-5, IL-13 and increased IFN-γ in BALF and lung tissues(P<0.05). The increased IκBα phosphorylation and NF-κB nuclear translocation after OVA inhalation were inhibited by the administration of sesamin. Conclusion Sesamin attenuates inflammation response of asthma through suppression of NF-κB activation

asthma；sesamin；airway inflammation；nuclear factor-kappa B；interleukin-4；interleukin-5；interferon-γ

时间：2015-3-3 11:08 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150303.1108.023.html

2014-11-29,

2014-12-27

国家自然科学基金资助项目(No 81260665)；吉林省科技厅项目(No 20130101121JC)；吉林省教育厅项目(No吉教科合字2014第21号)

李良昌(1978-)，男，博士，讲师，研究方向：过敏性疾病,Tel: 0433-2436152，E-mail:lclee@ybu.edu.cn; 李光昭(1962-)，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：过敏性疾病，通讯作者,E-mail: gzhli@ybu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.03.023

A

1001-1978(2015)03-0411-05

R-332；R284.1；R322.35；R364.5；R392.12；R562.25