间接免疫荧光法和酶联免疫吸附法检测抗线粒体抗体的分析与比较

王 艳，刘晓辉，张学智，彭清林，王国春

（中日友好医院 风湿免疫科，北京 100029）

抗线粒体抗体（antimitochondrial antibody，AMA）由Maokey 等于1958 年首次于原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）患者血清中发现， 是人体内一种无种属特异性和器官特异性的自身抗体。 目前临床上常用的检测抗线粒体抗体的方法为间接免疫荧光法（IIF），其检测的是总的抗线粒体抗体；酶联免疫吸附法（ELISA）检测的是与PBC 高度相关的AMA-M2 亚型。 理论上讲，IIF 法和ELISA 法检测的结果应该具有一致性，但临床中经常出现不一致的结果：ELISA 法测得AMA-M2 阳性，IIF 法测得AMA 阴性。 这常给临床医生对结缔组织病（connective tissue disease，CTD）的病情评估和诊断带来一定的干扰。 因此，本文总结了2 种方法在实际临床检测中的相关性，以提高该抗体对临床诊断的价值。

1 资料与方法

1.1 观察对象

选取2011 年1 月～2013 年6 月在我院门诊及住院患者中， 使用2 种检测方法：IIF 检测AMA和ELISA 法检测AMA-M2 且诊断明确的患者共726 例。 记录患者的AMA 检测结果及临床诊断。检测标本均为血清标本。

1.2 检测方法

1.2.1 间接免疫荧光法（IIF 法）

采用Euroimmun 试剂盒检测AMA，严格按试剂盒说明书操作。①加样品：用样品缓冲液将待检血清按1：100 比例稀释混匀，加25μl 标准品及稀释好的血清于倒扣板上，盖片，温育30min。 ②加荧光标记的抗体：加入荧光标记的二抗体液25μl于倒扣板，盖片，置30min。③用封片剂封片。④使用Olympus BX-51 荧光显微镜读片。

1.2.2 酶联免疫吸附法（ELISA 法）

采用Euroimmun 试剂盒检测血清AMA-M2水平并严格按试剂盒说明书操作。 ①加样品：用样品稀释缓冲液将待检血清按1：200 比例稀释，分别将1～5 号标准品、 质控品及稀释血清100pl加入用靶抗原包被的微孔中，温育30min。②加酶标抗体：加入酶标二抗体液100ml，振荡混匀后，置30min。③显色反应：加入显色剂各100ml，避光反应15min。④终止反应：加入终止液。⑤比色：将微孔板置于酶标仪上以450 nm 为主波长、630nm为副波长扫描测定各孔吸光度值。

1.3 统计学分析

采用Excel 2007 和SPSS16.0 软件处理测定数据。 IIF 和ELISA 法检测抗线粒体抗体结果的一致性采用Kappa 检验。

2结果

2.1 抗线粒体抗体检测结果

共计726 份标本，IIF 检测AMA 阳性47 份，阳性率为6.5%；ELISA 检测AMA-M2 阳性95份，阳性率为13.1% （表1）。 IIF 与ELISA 法检测抗线粒体抗体结果的一致率为91.4%， 二者具有一致性（P＜0.05）。 不一致时，以IIF 法AMA 阴性同时ELISA 法AMA-M2 阳性多见（7.6%）。

表1 IIF 与ELISA 检测抗线粒体抗体结果 n

表2 PBC 组与非PBC 组抗线粒体抗体分布n（%）

表3 AMA/AMA-M2 阳性患者的诊断n

2.2 IIF 与ELISA 诊断PBC 的准确率比较

以PBC 的临床诊断为金标准，726 份标本中37 份（5.1%）确诊PBC。 其他诊断为干燥综合征、类风湿关节炎、 肌炎、 硬皮病等多种疾病。 IIF、ELISA 检测对PBC 的确诊率分别为90% 、91.04%。 IIF 诊断PBC 的敏感性为78.4%，特异性为97.4%；ELISA 诊断PBC 的敏感性和特异性分别为100%和91.6%（表2）。

2.3 AMA/AMA-M2 阳性患者的诊断（表3）

ELLISA 和IIF 检测AMA 阳性 （AMA+/M2+）40 例：诊断PBC 29 例，占72.5%；其他CTD 7 例，占17.5%。 具体见表3。

2.4 AMA-/M2+组患者的数据分析

图1 AMA-/M2+组中，AMA-M2 抗体在其他CTD 和PBC 中的抗体滴度

表3 示，AMA-/M2+组诊断为其他CTD 的35例患者中，干燥综合征（SS）12 例（34.3%），系统性红斑狼疮6 例 （17.1%）。 女性29 例， 发病率82.8%；男性6 例，发病率17.1%。

其他CTD 组和PBC 组的AMA-M2 抗体浓度分布见图1。 2 组间（54.9RU/ml vs 64.8RU/ml）无统计学差异（P=0.055）。

3 讨论

正常人血清中无抗线粒体抗体存在。 一般多见于慢性肝炎、肝硬化患者和PBC 患者。 近年研究发现，AMA 也见于自身免疫病患者的血清中，如系统性红斑狼疮、干燥综合征等[1，2]。 AMA 的靶抗原是线粒体膜上的多种蛋白，成分复杂，现知有M1～M99 种成分。 其中，M2 亚型在临床辅助疾病的诊断及病情评估中意义最大，文献报道，AMAM2 见于90%的PBC 患者。 其诊断的靶抗原是线粒体内膜上的丙酮酸脱氢酶和α-酮酸脱氢酶的复合体， 是PBC 患者血清中AMA 反应的主要成分[3，4]。 系统性红斑狼疮，类风湿关节炎中检测的抗体滴度通常较低[4]，以干燥综合征（SS）最为常见，发生率高达47%～81%。有文献报道，还在慢性丙型肝炎中发现AMA-M2 抗体[5]。本研究中，抗线粒体抗体阳性的患者CTD发病率很高，尤其是AMA-/M2+组患者， 诊断为CTD 比率最高，为63.6%。其AMA-M2 抗体滴度集中于28～89RU/ml之间。 因此，在无特征性临床表现阶段，如肝功能ALP、GGT 升高等，单独的AMA-M2 阳性时，应结合其临床症状和免疫学指标， 考虑是否为其他CTD 的可能性。CTD 中，以SS 常见，3 组诊断率分别为AMA-/M2+，21.8%；AMA+/M2+，12.5%；AMA+/M2-，14.3%。 PBC 的发病与自身免疫、病原微生物感染、接触化学物品、遗传、环境因素等有关[6]，这与CTD 极为相似。

PBC 诊断的一个很重要的抗体是AMA，并且它和疾病的病理变化有很大关系， 和AST 及肺的纤维化高度相关[7]，与PBC 的病期、疾病严重程度、治疗效果均无相关性。 AMA-M2 亚型抗体见于90%的PBC 患者。 PBC 起病缓慢而隐匿，早期症状多不明显或不典型，常伴有高强度的AMA[8]。然而当早期仅有ALP、GGP 升高， 且合并其他CTD 时，常常会用一源论多系统损害来解释其肝损伤。 中晚期肝内及中等大小胆管的慢性淤胆性炎症，胆管破坏和闭塞，纤维化，导致肝硬化甚至肝功能衰竭，最终死于各种并发症[9]。

在很长一段时间被认为， 大约5%～10%被诊断为PBC 的患者，其AMA 是阴性的[8，10]。 本研究中，AMA-/M2+组，诊断为PBC 的患者多数归类于AMA 阴性， 他们在肝脏B 超排除胆道阻塞情况下，行肝活检病理检查而确诊。 虽然此种AMA 阴性的患者和抗体阳性的患者血清学指标有差异，但近年研究发现，这些患者的疾病进展过程，血清生化指标及肝脏组织学检查， 都和AMA 阳性患者没有明显差异[11，12]。 并且，此类患者的抗核抗体和抗平滑肌抗体更多的出现阳性[3，13，14]。

在本组AMA/AMA-A2 阳性诊断PBC 的37例患者中，AMA 阴性8 例；无M2 阴性患者。 由于样本数量的局限性， 不排除有M2 阴性患者诊断为PBC[10]。本研究显示，针对医院就诊人群，ELISA检 测AMA-M2 的 阳 性 率（13.1% ） 高 于IIF（6.5%），但二者结果基本一致。2 种方法检测结果存在8.5%的不一致， 其中以IIF 法阴性同时ELISA 法AMA-M2 阳性多见（7.6%）。 2 种检测方法诊断PBC 的准确率均在90%以上，说明都能较好的用于PBC 诊断。IIF 检测虽然特异性较高，但敏感度只有78.4%；ELISA 虽然敏感性较高，但是特异性不如IIF。 因此，我们认为IIF 和ELISA 应同时进行，以增加诊断的敏感度和特异性。

上述2 种检测AMA 的方法，其结果不一致，原因可能有以下几种：（1）抗原递呈给抗体的载体不同。 （2）抗体亲和力不同。 IIF 阳性而ELISA 阴性， 则是因为AMA 成分复杂，M2 型抗原是其近百种亚型抗原中的一种。

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