基于ITS序列对紫薇的分子鉴定

冯媛媛+夏珊+曾其国+冯鸿+薛飞龙+赖麟

摘要：对紫薇属植物细胞核核糖体DNA转录间隔区（nrDNA ITS）序列进行分析，为紫薇植物的鉴定提供分子依据。通过提取紫薇幼苗总DNA，对nrDNA ITS序列进行PCR扩增测序，应用软件BioEdit、DNAMAN进行序列分析，MEGA计算遗传距离，构建基于K2P模型的NJ系统发育树。测序得到2条nrDNA ITS序列，长度均为615 bp。序列分析结果显示，序列1与紫薇ITS序列相似性达99.03%，遗传距离为0.003，聚类分析归为一支;序列2与毛紫薇ITS序列相似性达98.55%，遗传距离0.007，聚类分析归为一支。试验结果说明，基于nrDNA ITS序列分析法，能够对紫薇属植物进行准确的分子鉴定，从而为紫薇属的种类鉴定和种间亲缘关系提供分子生物学理论依据。

关键词：紫薇;分子鉴定;ITS序列;相似性

中图分类号： S685.990.1 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0067-02

收稿日期：2014-05-15

基金项目：四川省科技支撑计划（编号：2012FZ0049）;四川省科技富民强县专项行动计划。

作者简介：冯媛媛（1970—），女，江苏淮安人，博士，讲师，主要从事植物发育生理与分子生物学研究。E-mail：fyuyang_12@163.com。

通信作者：赖 麟，硕士，教授，主要从事植物遗传育种研究。Tel：（028）66772002;E-mail：lailin127@126.com。

紫薇属（Lagerstroemia Linn.）植物为千屈菜科（Lythraceae）落叶或常绿的灌木或乔木，主要分布在亚洲东部、东南部、南部和澳大利亚的北部。我国目前共有紫薇属植物24种，其中4种为我国特有[1]。紫薇属植物大多数种类有大而美丽的花，花期长达3个多月，具有较高的观赏价值，在园林绿化中得到广泛的应用。紫薇属少数植物被用作传统药物，如据我国民间记载，紫薇（Lagerstroemia indica L.）有活血、止血、消风、清热、解毒的功能，具有抗流感病毒、抗真菌作用，用于治疗产后血崩、洗疥癞癣疮[2];在菲律宾，大花紫薇（Lagerstroemia speciosa Pers.）的叶被用于治疗糖尿病和肾病[3];在印度，小叶紫薇（Lagerstroemia parviflora Roxb.）被作为止咳药和收敛药使用[4]。由于部分紫薇在自然生长状态下外观差异极小，仅靠传统的鉴定方法对其进行分类存有较大争议，需要分子生物学提供更多证据支持[1]。

随着分子生物学在物种鉴定领域的发展，DNA条形码技术在植物鉴定方面显示出了极其重要的作用。在众多条形码中，细胞核核糖体DNA内部转录间隔区（nrDNA ITS）序列因具有高分辨率的特点，被广泛用于被子植物物种鉴定和亲缘关系分析中[5-6]。已有学者采用RAPD、AFLP等分子标记技术研究紫薇品种和种间亲缘关系[7-8];但与RAPD、AFLP、SSR和SRAP等相比，采用ITS构建系统发育树，具有省时、省工和结果更加可靠等优点[9]。本研究通过扩增待检测紫薇属植物的ITS片段，对ITS序列进行比较分析，对待检紫薇进行分类鉴定，探讨紫薇种内和种间的遗传变异以及它们之间的亲缘关系，为紫薇种质资源的鉴定及系统学研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

紫薇种子购自云南昆明。大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α菌株为笔者所在实验室保存。Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、pBLUE-T载体、T4 DNA连接酶购自Aidlab公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Tiangen公司。

1.2 方法

紫薇种子灭菌萌发后，采用改良CTAB法[10]提取幼苗总DNA。参照He等的方法[11]，根据不同物种间同源基因的核酸序列相对保守的特点，设计紫薇属ITS的通用扩增引物：ITS-F：5′-GAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′和ITS-R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，由成都金杰生物技术有限公司合成。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃复性45 s，共30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR 扩增产物回收后，连接到pBLUE-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选后送六合华大基因科技股份有限公司测序。

使用BioEdit软件编辑ITS序列，DNAMAN软件比对分析序列同源性和GC含量，MEGA软件分析K2P（Kimura-2 parameter）遗传距离，用NJ（Neighbor-Joining）法构建系统树，系统树各分支的置信度用自展检验法（bootstrap test）检验，共1 000次循环，以评价各分支的系统学意义与可靠性。

2 结果与分析

2.1 紫薇样品nrDNA ITS PCR扩增

以紫薇样品总DNA为模板进行nrDNA ITS序列的PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。样品nrDNA ITS序列PCR条带大小约750 bp，主条带清晰，非特异性条带少。

2.2 ITS序列分析

挑取10个紫薇样品各2个单克隆测序，获得样品nrDNA ITS序列长度为721 bp，合并相同序列后， 最终得到2条差异

较大的序列。将2条样品ITS序列在GenBank中进行blast，得到与序列1相似性最高的序列是紫薇（AF201689.1），与序列2相似性最高的序列是毛紫薇（Lagerstroemia villosa，AY035755.1）。通过BioEdit和DNAMAN软件比对分析，序列1与紫薇的相似性为99.03%，有6个变异位点;序列2与毛紫薇的相似性为98.55%，有9个变异位点。ITS序列各部分长度和GC含量差异见表1。

表1 紫薇样品ITS序列长度和GC含量比对

种类 ITS序列长度（ITS1+5.8S+ITS2）

（bp） GC含量（ITS1+5.8S+ITS2）

（%）

样品序列1 615（236+164+215） 64.4（67.3+56.1+67.4）

紫薇（AF201689.1） 618（236+164+218） 63.8（66.9+56.1+66.1）

样品序列2 615（236+164+215） 64.4（66.9+56.1+67.9）

毛紫薇（AY035755.1） 618（237+164+217） 63.6（65.9+54.8+67.7）

2.3 紫薇遗传距离分析

使用MEGA软件分析2种紫薇样品序列与高同源性（90%以上）紫薇ITS序列的K2P遗传距离，结果见表2。与样品1距离最小的是紫薇（0.003），其次是毛紫薇和绒毛紫薇（Lagerstroemia tomentasa，AF201688.1），距离分别是0.020和0.015，再次是大花紫薇和Lagerstroemia hirsuta，距离都是0.053，距离最远的是小叶紫薇（0.058）。与样品2距离最小的是毛紫薇（0.007），其次是紫薇和绒毛紫薇，距离分别是0013和0.018，距离较远的是大花紫薇、小叶紫薇和L. hirsuta。

2.4 紫薇聚类分析

将2条紫薇样品ITS序列与紫薇属部分ITS序列进行系统进化聚类分析，外类群选取与紫薇属近缘的八宝树属（Duabanga）[12]，结果见图2。从图2可以看出，ITS序列构建的分子系统树上，样品1和紫薇聚成一类，样品2和毛紫薇聚

表2 紫薇ITS序列种内种间K2P遗传距离

种类

遗传距离

1 2 3 4 5 6 7

2 0.035

3 0.048 0.051

4 0.058 0.064 0.064

5 0.053 0.058 0.053 0.020

6 0.062 0.065 0.056 0.025 0.012

7 0.053 0.058 0.053 0.020 0.003 0.015

8 0.051 0.056 0.056 0.007 0.013 0.018 0.013

注：1.大花紫薇;2.小叶紫薇;3. Lagerstroemia hirsuta;4.毛紫薇;5.紫薇;6.绒毛紫薇;7.样品1;8.样品2。

为一类。紫薇、毛紫薇、绒毛紫薇聚为一个分支，大花紫薇、小叶紫薇、L. hirsuta（JX856469.1）聚为另外一个分支。

3 讨论

ITS序列1与紫薇ITS序列相似性为99.03%，遗传距离为0.003，聚类分析将其归为一支，由此可以确定含有ITS序列1的样品为紫薇;序列2与毛紫薇ITS序列相似性为9855%，遗传距离0.007，聚类分析归为同一支，支持率99%，可确定序列2样品为毛紫薇。此结果说明，可通过比对未知紫薇的ITS序列与已有紫薇的ITS序列来鉴别紫薇种类。

本研究对NCBI中紫薇ITS序列进行系统进化分析发现，6种紫薇属植物被聚为2类，大花紫薇、小叶紫薇和L. hirsuta亲缘关系较近，紫薇、毛紫薇和绒毛紫薇亲缘关系较近。根据外类群确定法，大花紫薇、小叶紫薇、L. hirsuta出现较紫薇、毛紫薇、绒毛紫薇早，L. hirsuta在6种紫薇植物中最原始。此结果与Shi等的研究结果[12]相似，说明ITS序列可以用于研究紫薇的亲缘关系。

本研究供试材料为市场上购买的同一批紫薇种子萌发后的幼苗，通过ITS测序，表明该批紫薇种子中有毛紫薇掺杂，但紫薇样品ITS序列与NCBI上紫薇ITS序列的差异是否稳定还需要收集更多的紫薇样本加以验证。

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