RP-HPLC同时测定复方替硝唑溶液中替硝唑和醋酸氯己定的含量

高磊 贾燕花 王晓青 刘皈阳

·药物研究·

RP-HPLC同时测定复方替硝唑溶液中替硝唑和醋酸氯己定的含量

高磊 贾燕花 王晓青 刘皈阳

目的建立同时测定复方替硝唑溶液中替硝唑和醋酸氯己定含量的反相高效液相色谱方法(RP-HPLc)。方法采用高效液相色谱法，C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相以甲醇为流动相A，甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(pH 3.5)(20∶80)为流动相B，采用梯度洗脱方法;检测波长为280 nm。结果替硝唑和醋酸氯己定的含量分别在80.2～280.7 μg/ml、80.28～280.98 μg/ml的范围内线性关系良好，平均回收率分别为100.08%和100.33%(n=6)。结论该方法操作简便，结果可靠，可以用于同时测定复方替硝唑溶液中替硝唑和醋酸氯己定的含量，以控制该制剂的质量。

替硝唑;醋酸氯己定;高效液相色谱法;含量测定

复方替硝唑溶液临床上用于口腔厌氧菌感染及其他细菌感染引起的咽峡炎、牙周炎及口腔溃疡等，主要成分为替硝唑和醋酸氯己定等。该制剂质量标准中仅采用紫外分光光度法控制替硝唑的含量，未进行醋酸氯己定的含量控制。因此，参考相关文献［1-12］，在保证测定结果的准确度和良好的检测效率的前提下，笔者通过摸索实验条件，建立了同时定量检测复方替硝唑溶液中替硝唑和醋酸氯己定的反相高效液相色谱法(RP-HPLc)，以便提供安全、有效的药品。

1 仪器与试药

1.1 仪器高效液相色谱仪(1100，Agilent)，色谱柱(C18，Thermo Scientific)，pH计(pHS-3E，上海雷磁)，紫外分光光度计(UV-2450，日本岛津)，电子天平(BT25S，赛多利斯)。

1.2 试药替硝唑(100336-200703，中国食品药品检定研究院)，醋酸氯己定(100183-201003，中国食品药品检定研究院)，复方替硝唑溶液(20130724，130806A，第三军医大学第三附属医院;130814，中国人民解放军总医院第175医院;1307371，上海长海医院)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇为流动相A，甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(pH值3.5)(20∶80)为流动相B，流速为每分钟1 ml，照下表进行梯度洗脱;检测波长280 nm;进样量为10 μl。

时间(min)流动相A(%)流动相B(%) 100 8 5545 155546 15.10100 0 0 200100

2.2 对照品溶液的配制替硝唑对照品溶液的配制:精密称取替硝唑对照品适量，置于量瓶中，加水溶解并稀释制成每1毫升中约含替硝唑0.2 mg的溶液，作为替硝唑对照品溶液;醋酸氯己定对照品溶液的配制:精密称取醋酸氯己定对照品质量，置于量瓶中，加水溶解并稀释制成每1毫升中约含醋酸氯己定0.2 mg的溶液，作为醋酸氯己定对照品溶液;混合对照品溶液制备:分别精密称取替硝唑对照品和醋酸氯己定对照品各适量，置于同一容量瓶中，加水溶解并稀释制成每1毫升中约含替硝唑0.2 mg、醋酸氯己定0.2 mg的溶液，作为混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的配制取供试品适量，滤过，即得。

2.4 阴性样品溶液的配制按照处方比例，精密称取20 mg甜叶菊苷置于50 ml量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5 系统适用性实验按“2.1”项下的色谱条件，精密量取替硝唑对照品溶液、醋酸氯己定对照品溶液、阴性样品溶液各10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。主成分甲硝唑、酮康唑和丙酸氯倍他索的色谱峰分离度良好。见图1。

2.6 线性关系考察精密称取替硝唑对照品20 mg，醋酸氯己定对照品20 mg，置同一50 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为线性储备液;分别精密量取2、3、4、5、6、7 ml置10 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为线性供试液。精密量取上述供试液10 μl进样，按照“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，以峰面积的积分值为纵坐标(Y)，分别以替硝唑和醋酸氯己定浓度(μg/ml)为横坐标(X)作标准曲线，计算其回归方程。替硝唑:Y=7.16X+7.38，r= 0.9995;醋酸氯己定:Y=12.37X-9.23，r=0.9995。结果表明，替硝唑和醋酸氯己定分别在80～280 μg/ml、80～280 μg/ml的范围内线性关系良好，符合规定。

图1 替硝唑对照品(A)、供试品溶液(B)、醋酸氯己定对照品(C)、阴性样品(D)色谱图

2.7 精密度实验精密量取混合对照品溶液10 μl，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，计算替硝唑和醋酸氯己定的吸收峰面积RSD值，分别为0.13%和0.04%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性实验精密量取供试品溶液，在相同色谱条件下分别于0、6、12、24、48 h精密量取10 μl，记录峰面积，计算替硝唑和醋酸氯己定的吸收峰面积RSD值，分别为0.06%和0.12%，结果表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.9 重复性实验取批号为130814的复方替硝唑，按照“2.3”项下的方法制备6份供试品溶液，并按照“2.1”项下的色谱方法平行测定，替硝唑和醋酸氯己定含量的RSD值分别为0.09%和0.53%(n=6)，结果表明该方法重复性良好。

2.10 准确度实验分别精密称取替硝唑对照品适量(相当于替硝唑16 mg、20 mg、24 mg，相当于醋酸氯己定16 mg、20 mg、24 mg)，置于100 ml量瓶中，按照处方比例加入辅料，加水溶液并稀释至刻度，摇匀，即得浓度分别为80%、100%、120%的供试品溶液，每种浓度制备3份，按“2.1”项下的色谱条件进样，测定峰面积，按照外标法计算各水平的回收率。替硝唑的平均回收率为100.08%，RSD值为0.79%;醋酸氯己定的平均回收率为100.33%，RSD值为1.07%。

2.11 样品测定按照上述色谱条件，分别精密量取供试品溶液和对照品溶液各10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按照外标法以峰面积计算样品的含量。见表2。

表1 样品含量测定结果%

3 讨论

替硝唑在317 nm处有较强吸收;醋酸氯己定在255 nm处有较强吸收;空白辅料在280 nm处无吸收。故选择280 nm作为本品的检测波长。

供试品经滤过后直接进样，响应值符合高效液相色谱法含量测定的要求，该供试品制备方法简便，易于常规操作。同时，由于该制剂主要溶剂为水，因此首选水作为对照品溶液制备的溶剂，并获得良好的峰形。

《中华人民共和国药典》2010年版二部中的替硝唑原料药［13］和醋酸氯己定原料药［13］采用容量分析方法，笔者尝试建立了同时测定替硝唑和醋酸氯己定的高效液相色谱方法，该方法具有良好的专属性、精密性和准确性，以及良好的分离效能，为复方氯倍他索乳膏的质量控制提供了可靠的依据。

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R 917

A

1002-7386(2015)02-0290-02

2014-09-11)

10．3969/j．issn．1002－7386．2015．02．051

100048北京市，中国人民解放军总医院第一附属医院药剂药理科

刘皈阳，100048中国人民解放军总医院第一附属医院药剂药理科; E-mail:liuguiy@live.cn