高效液相梯度洗脱法同时测定情安喘定片5种成分

林源

(浙江省温岭市中医院药剂科，温岭 317500)

高效液相梯度洗脱法同时测定情安喘定片5种成分

林源

(浙江省温岭市中医院药剂科，温岭 317500)

目的 采用高效液相梯度洗脱法，同时测定情安喘定片中芸香苷、槲皮苷、补骨脂素、佛手柑内酯和芹菜素含量。方法 采用依利特Hypersil C18色谱柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：0.9 mL·min-1；以甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B)为流动相进行梯度洗脱；检测波长：芸香苷和槲皮苷为254 nm，补骨脂素、佛手柑内酯和芹菜素为269 nm，柱温为35 ℃。结果 芸香苷、槲皮苷、补骨脂素、佛手柑内酯和芹菜素质量浓度分别在6.06～121.20 μg·mL-1(r=0.999 9)、5.80～116.00 μg·mL-1(r=0.999 2)、4.65～93.00 μg·mL-1(r=0.999 7)、7.10～142.00 μg·mL-1(r=0.999 5)、6.30～126.00 μg·mL-1(r=0.999 3)时与其峰面积呈良好的线性关系；芸香苷、槲皮苷、补骨脂素、佛手柑内酯和芹菜素的平均加样回收率分别为99.26%，98.28%，97.12%，98.05%，96.72%，RSD(n=6)分别为0.76%，1.54%，0.64%，0.87%，0.61%。结论 该方法是一种快速、灵敏、准确的分析方法，可用于情安喘定片的质量控制。

情安喘定片；芸香苷；槲皮苷；补骨脂素；佛手柑内酯；芹菜素

情安喘定片处方源自国家药品标准中药成方制剂第九册[1]，由鱼腥草、五指毛桃、榕树叶、胡颓子、珍珠层粉、冰片、盐酸双氯醇胺等7味药物组成，气芳香，味苦涩、辛。具有平喘、止咳、祛痰、消炎之功效，可用于慢性支气管炎、支气管哮喘等症的治疗。鱼腥草和五指毛桃为方中的主要药物，原部颁标准中仅对性状和个别药材进行显色鉴别，未对方中的任何药物进行含量测定[1-2]，很难有效控制产品的质量和疗效。笔者采用高效液相梯度洗脱法对情安喘定片鱼腥草中的芸香苷、槲皮苷和五指毛桃中的补骨脂素、佛手柑内酯、芹菜素进行含量测定，为完善该制剂质量标准提供依据。本方法快速、灵敏、准确，可作为情安喘定片中芸香苷、槲皮苷、补骨脂素、佛手柑内酯和芹菜素的控制方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1200 高效液相色谱仪(安捷伦科技(中国)有限公司，含G1311A四元泵、G1330B自动进样器恒温器、G1322A脱气机、Chemstation色谱工作站、G1315B可变波长检测器)。

1.2 试药 芸香苷对照品(批号：100080-201408，含量：90.2%)、槲皮苷对照品(批号：111538-200504，含量：92.9%)、补骨脂素(批号：110739-201115，含量：99.3%)、芹菜素(批号：111901-201102，含量：99.6%，置五氧化二磷干燥器中减压干燥12 h后使用)均购于中国食品药品检定研究院；佛手柑内酯(批号：484-20-8，含量：98.0%)购于上海同田生物技术有限公司；情安喘定片(规格：每片0.4 g，批号：131003，131005，131006)购于厦门中药厂有限公司；阴性对照实验药材均购于浙江省临海医药有限公司中药饮片厂，经各自药材国家标准检验均符合要求；甲醇(色谱纯，批号：20130507，含量：≥99.9%)、乙腈(色谱纯，批号：20141006，含量：≥99.9%) 购于天津市康科德科技有限公司；磷酸(分析纯，批号：20140608，含量：≥85.0%)购于广州化学试剂二厂。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 依利特Hypersil C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A为甲醇，流动相B为0.1%磷酸溶液[3-9]，梯度洗脱(0～10 min，20.0%A；～20 min，20.0%A→25.0%A；～40 min，25.0%A→35.0%A；～46 min，35.0%A→20.0%A)；检测波长(0～20 min，λ1=254 nm[10]；～46 min，λ2=269 nm[11])；流速为0.9 mL·min-1；柱温为35 ℃；进样量20 μL。此系统条件下所测组分与其他组分分离效果良好，理论板数按芹菜素计算不得低于2 000，分离度均>2.0。

2.2 混合对照品溶液配制 取5种对照品芸香苷、槲皮苷、补骨脂素、佛手柑内酯和芹菜素各适量，精密称定，分别置5个20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制得芸香苷、槲皮苷、补骨脂素、佛手柑内酯和芹菜素质量浓度分别为0.606，0.580，0.465，0.710，0.630 mg·mL-1的对照品储备溶液。再分别精密吸取上述对照品储备溶液5，2，4，2，1 mL置同一个50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得芸香苷、槲皮苷、补骨脂素、佛手柑内酯与芹菜素质量浓度分别为0.060 6，0.023 2，0.037 2，0.028 4，0.012 6 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，混匀，称取约1.0 g，精密称定，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声波超声提取40 min，取出，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液的制备 按情安喘定片处方比例称取除鱼腥草的其余药味和除五指毛桃的其余药味各1份，按情安喘定片的制备工艺分别制成鱼腥草阴性对照样品和五指毛桃阴性对照样品[1]，按照“2.3”项下供试品溶液的制备方法制成鱼腥草阴性对照溶液和五指毛桃阴性对照溶液。

2.5 专属性实验 分别精密吸取供试品溶液、混合对照品溶液、鱼腥草阴性对照溶液及五指毛桃阴性对照溶液20 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，结果在与芸香苷、槲皮苷、补骨脂素、佛手柑内酯和芹菜素对照品色谱图相应的保留时间处，供试品溶液色谱图中有吸收峰；而鱼腥草阴性对照溶液色谱图中未显示芸香苷和槲皮苷吸收峰；五指毛桃阴性对照溶液色谱图中未显示补骨脂素、佛手柑内酯和芹菜素吸收峰。色谱图见图1。

2.6 线性关系考察 分别精密吸取“2.2”项下各对照品储备溶液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 mL，分别置5个10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。按“1.2”项下色谱条件进行测定，以峰面积Y与对照品质量浓度X，得芸香苷回归方程为：Y=2.326 5×104X+513.4，r=0.999 9，线性范围为6.06～121.20 μg·mL-1；槲皮苷Y=5.321 8×103X+317.1，r=0.999 2，线性范围为5.80～116.00 μg·mL-1；补骨脂素Y=1.569 9×104X+602.7，r=0.999 7，线性范围为4.65～93.00 μg·mL-1；佛手柑内酯Y=1.098 1×104X+291.9，r=0.999 5，线性范围为7.10～142.00 μg·mL-1；芹菜素Y=6.021 8×103X-591.3，r=0.999 3，线性范围为6.30～126.00 μg·mL-1。结果表明：芸香苷、槲皮苷、补骨脂素、佛手柑内酯和芹菜素在各自的线性范围内，所测组分质量浓度与峰面积线性关系良好。

2.7 精密度实验 取“2.2”项下的混合对照品溶液按照“2.1”项下色谱条件，精密吸取混合对照品溶液20 μL，连续重复进样6次，分别测得5种成分的峰面积，峰面积RSD分别为0.57%，0.98%，0.33%，0.56%和0.85%。结果表明，仪器精密度良好。

A.鱼腥草阴性对照溶液；B.五指毛桃阴性对照溶液；C.对照品；D.样品；1.芸香苷；2.槲皮苷；3.补骨脂素；4.佛手柑内酯；5.芹菜素

图1 芸香苷、槲皮苷、补骨脂素、佛手柑内酯和芹菜素的HPLC图

2.8 重复性实验 称取同一批号供试品，按“2.2”项下供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件依法进样测定，计算各成分含量RSD分别为0.67%，0.25%，0.81%，0.59%和0.91%。结果表明，本法测定重复性良好。

2.9 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液(批号：131003)，在室温下放置0，2，4，8，12，24 h后，每次进样20 μL，测定其峰面积值，芸香苷、槲皮苷、补骨脂素、佛手柑内酯和芹菜素峰面积的RSD分别为0.52%，0.83%，0.29%，0.50%和0.73%。表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.10 加样回收率实验 取已知含量的同一批情安喘定片(批号：131003，芸香苷为3.13 mg·g-1、槲皮苷为1.18 mg·g-1，补骨脂素为1.95 mg·g-1，佛手柑内酯为1.44 mg·g-1，芹菜素为0.628 mg·g-1) 适量，研细，混匀，取约0.5 g，精密称定，精密加入混合对照品溶液25 mL和甲醇25 mL，按“2.3”项下供试品溶液的配制方法制备加样供试品试液。按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算5种组分回收率，结果见表1。

2.11 样品测定 取3个批号的样品甲组成分，按“2.3”项下供试品制备方法，按“2.1”项下色谱条件测定本品中芸香苷、槲皮苷、补骨脂素、佛手柑内酯和芹菜素含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择 实验过程中考察流动相乙腈-水梯度洗脱、甲醇-水梯度洗脱、甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脱，结果以甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脱时色谱峰分离较好，分离度均>2.0。本方法采用多波长梯度洗脱法同时测定情安喘定片中5种成分的含量，对有效控制该品种的质量和疗效意义重大。芸香苷和槲皮苷的检测波长参考文献资料[10]和预实验结果，该组分检测波长定为254 nm；补骨脂素、佛手柑内酯和芹菜素的检测波长参考文献资料[11]和预实验结果，该组分检测波长定为269 nm。

表1 芸香苷、槲皮苷、补骨脂素、佛手柑内酯和芹菜素加样回收率实验

批号芸香苷槲皮苷补骨脂素佛手柑内酯芹菜素1310031.25±0.010.472±0.0020.780±0.0050.576±0.0050.251±0.0071310051.39±0.020.523±0.0050.812±0.0080.594±0.0020.262±0.0031310061.16±0.010.491±0.0030.764±0.0030.569±0.0040.255±0.006

3.2 供试品溶液提取方法的选择 在供试品溶液制备过程中，分别考察了加热回流法、超声提取法对芸香苷、槲皮苷、补骨脂素、佛手柑内酯和芹菜素5种成分的提取效率，结果显示加热回流提取与超声提取法效率相当，但考虑到超声波超声提取较加热回流简便易行，故选取超声提取法；超声提取时间选取20，40，60 min进行考察，结果超声提取40 min和超声提取60 min提取率相差不大，但明显高于提取20 min，故选取超声波超声提取40 min作为该品种中芸香苷、槲皮苷、补骨脂素、佛手柑内酯和芹菜素含量测定供试品溶液的提取方法。

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DOI 10.3870/yydb.2015.08.027

2014-05-19

2014-08-05

林源(1984-)，男，浙江温岭人，主管中药师，学士，研究方向：中药学。电话：(0)13566665731，E-mail：lunwenlinyuan@163.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)08-1086-04