HPLC-ELSD法测定人工牛黄甲硝唑胶囊中胆酸和猪去氧胆酸的含量

徐陆忠，严莺，周学琴

(上海市第十人民医院临床药学科，上海 200072)

HPLC-ELSD法测定人工牛黄甲硝唑胶囊中胆酸和猪去氧胆酸的含量

徐陆忠，严莺，周学琴

(上海市第十人民医院临床药学科，上海 200072)

目的 建立高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)法测定人工牛黄甲硝唑胶囊中胆酸和猪去氧胆酸的含量。 方法 色谱柱为Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-1%冰醋酸溶液(80：20)；流速为1.0 mL·min-1；柱温为30 ℃；漂移管温度为80 ℃；氮气流速为2.0 L·min-1。 结果 胆酸在1.188～17.820 μg范围内呈良好的线性关系，r=0.999 3，平均回收率为98.04%，RSD=1.60%(n=6)；猪去氧胆酸在1.026～15.383 μg范围内呈良好的线性关系，r=0.999 8，平均回收率为99.03%，RSD=2.06%(n=6)。 结论 该方法简便、准确、重复性好，可为人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准的完善提供依据。

人工牛黄甲硝唑胶囊；胆酸；猪去氧胆酸；检测器，高效液相色谱-蒸发光散射；含量测定

人工牛黄甲硝唑胶囊为国家药品标准收载的中西药复方制剂，由人工牛黄和甲硝唑组成，临床主要用于急性智齿冠周炎、局部牙槽脓肿、牙髓炎、根尖周炎的治疗。现有标准通过测定胆红素的含量控制该制剂中人工牛黄的质量，但是胆红素仅仅是人工牛黄诸多有效成分之一，单纯测定胆红素的量不能全面反映该制剂中人工牛黄的品质。胆酸和猪去氧胆酸是人工牛黄的重要组成成分，两者的含量直接影响人工牛黄的品质。因此，为了更好地控制人工牛黄甲硝唑胶囊的质量，参考文献[1-4]，采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器(high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，HPLC-ELSD)法测定制剂中胆酸和猪去氧胆酸的含量，为进一步完善质量标准提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Alltech 2000ES 蒸发光散射检测器(美国Alltech公司)；XS205 Dual Range十万分之一分析天平(METTLER TOLEDO公司)；USC-502超声波清洗仪(上海波龙电子设备有限公司)。

1.2 试药 胆酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100078-200414，含量：98.0%)；猪去氧胆酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100087-200610，含量：97.3%)；人工牛黄甲硝唑胶囊(收集于不同厂家，5批)；甲醇为色谱纯，水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-1%冰醋酸溶液(80：20)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；漂移管温度：80 ℃；氮气流速：2.0 L·min-1。

2.2 对照品溶液的制备 取胆酸对照品29.70 mg、猪去氧胆酸对照品26.35 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取本品内容物，研细，精密称取适量(相当于人工牛黄25 mg)，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，称定质量，超声处理30 min，放至室温，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性溶液的制备 取缺牛胆粉、胆酸和猪去氧胆酸3种原料的人工牛黄，按处方比例与甲硝唑及辅料混匀，按“2.3”项方法制备阴性溶液。

2.5 方法专属性考察 精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性溶液，按“2.1”项色谱条件测定。结果见图1。胆酸和猪去氧胆酸与供试品溶液中的其他组分达到基线分离，且阴性溶液在胆酸和猪去氧胆酸相应保留时间处无干扰峰，表明该方法专属性好。

2.6 线性关系考察 精密吸取对照品溶液2，6，10，20，30 μL，按“2.1”项色谱条件测定胆酸和猪去氧胆酸峰面积，以进样量的自然对数为横坐标，以峰面积的自然对数为纵坐标进行线性回归，胆酸的回归方程为Y=1.612 9X+12.473，r=0.999 3，猪去氧胆酸的回归方程为Y=1.658 5X+12.776，r=0.999 8，表明胆酸和猪去氧胆酸分别在1.188～17.820，1.026～15.383 μg范围内呈良好的线性关系。

A.阴性溶液；B.对照品溶液；C.供试品溶液；1.猪去氧胆酸；2.胆酸

2.7 精密度实验 精密吸取对照品溶液20 μL，连续进样6次，记录色谱图。结果，胆酸和猪去氧胆酸峰面积的RSD分别为0.32%，0.24%，表明精密度良好。

2.8 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液20 μL，于0，2，4，6，8，10，12 h进样，记录色谱图。结果，胆酸和猪去氧胆酸峰面积的RSD分别为1.26%，1.41%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.9 重复性实验 取同一供试品6份，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定并计算含量。结果，胆酸和猪去氧胆酸含量的RSD分别为0.78%，0.61%，表明本方法重复性较好。

2.10 加样回收率实验 精密称取已知含量的同一批供试品6份，精密加入对照品溶液2.0 mL，再精密加入甲醇8.0 mL按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，记录色谱图，计算胆酸和猪去氧胆酸平均回收率分别为98.04%，99.03%，RSD分别为1.60%，2.06%。见表1，2。

表1 胆酸加样回收率实验结果

2.11 样品的含量测定 分别取5个厂家的5批人工牛黄甲硝唑胶囊，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，记录色谱图，按外标两点对数法计算每粒样品中胆酸和猪去氧胆酸的含量。结果见表3。

3 讨论

胆酸类成分在醇类溶剂中具有较高溶解度，因此，供试品溶液制备时选择了甲醇作为提取溶剂，考察了超声、加热回流两种提取方法，结果超声提取时胆酸和猪去氧胆酸的回收率较高。

表2 猪去氧胆酸加样回收率实验结果

表3 5个厂家每粒样品中胆酸和猪去氧胆酸测定结果

mg，n=3

流动相选择时，比较了甲醇-乙腈-0.5%冰醋酸溶液(49：20：31)、甲醇-1%冰醋酸溶液(80：20)、乙腈-0.5%冰醋酸溶液(40：60)等多组流动相，结果显示以甲醇-1%冰醋酸溶液(80：20)为流动相时，出峰时间适宜，色谱峰对称性好，且能与其他组分实现基线分离。胆酸和猪去氧胆酸含量较低，因此，ELSD选择不分流模式，且通过调节漂移管温度和氮气流速，确保在较低的基线噪音前提下，使胆酸和猪去氧胆酸具有较高的响应值。

通过对市售的人工牛黄甲硝唑胶囊中胆酸和猪去氧胆酸测定，结果各个厂家之间具有较大差异。《中华人民共和国药典》2010年版虽然对人工牛黄提出较高的质量要求，但现行标准对含人工牛黄的制剂仍以胆红素这单一指标进行控制，显然不足以全面反映该类制剂的质量，通过HPLC-ELSD法测定胆酸和猪去氧胆酸的含量，可为该制剂质量标准的完善提供依据。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：中国医药科技出版社，2010：1106-1107.

[2] 钟名诚，肖聪，于境.HPLC-ELSD法测定胆黄片中猪去氧胆酸的含量[J].中国药品标准，2010，11(2)：121-124.

[3] KONG W J，JIN C，XIAO X H，et al.Determination of multi-component contents inCalculusbovisby ultra-performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection and its application for quality control[J].J Separat Sci，2010，33(10)：1518-1527.

[4] 石岩，孙冬梅，魏锋，等.体外培育牛黄中主要胆酸类成分的测定[J].药物分析杂志，2013，33(6)：1045-1047.

DOI 10.3870/yydb.2015.05.024

2014-02-08

2014-05-01

徐陆忠(1983-)，女，浙江湖州人，药师，硕士，研究方向：药物新剂型及新技术。电话：021-66307704，E-mail：xuluzhong_83@126.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)05-0658-03