近红外发光葡聚糖纳米胶活体成像小鼠淋巴结

李洁静 蒋蓓绮 宋焱艳 林 超 庄志刚△

(1同济大学附属第一妇婴保健院乳腺外科 上海 200092;2同济大学纳米研究院 上海 200082)

近红外发光葡聚糖纳米胶活体成像小鼠淋巴结

李洁静1蒋蓓绮1宋焱艳2林 超2庄志刚1△

(1同济大学附属第一妇婴保健院乳腺外科 上海 200092;2同济大学纳米研究院 上海 200082)

目的 制备和研究荧光染料标记的葡聚糖纳米胶,用于活体荧光成像小鼠腋窝淋巴结。方法 使用脱氧胆酸和荧光染料Cy7化学标记葡聚糖,通过透析法制备纳米胶Dextran-Cy7;使用透射电子显微镜、动态光散射仪分别表征纳米胶的形貌及大小;分光光度法标定Cy7的含量;用C57小鼠和DC2.4细胞分别评价Dextran-Cy7的体内、体外毒性;对10只正常昆明小白鼠经前掌注射Dextran-Cy7生理盐溶液,使用活体荧光扫描成像系统观察小鼠腋窝淋巴结的成像效果;淋巴结免疫荧光组化法观察Dextran-Cy7在淋巴结内的分布。结果 Dextran-Cy7纳米胶是直径30～50 nm的球形纳米颗粒,其在体内和体外都具有较低的细胞毒性,可作为近红外发光探针活体荧光成像小鼠腋窝淋巴结;纳米胶主要分布在淋巴结的巨噬细胞细胞内。结论 Dextran-Cy7纳米胶细胞毒性低、生物相容性好,可作为纳米荧光探针成像活体小鼠淋巴结。

淋巴结; 近红外荧光成像; 荧光染料Cy7; 葡聚糖; 纳米胶

恶性肿瘤已成为影响我国人民健康的重要疾病之一。淋巴结转移的临床诊断是目前肿瘤治疗及术后化疗方案的重要依据。前哨淋巴结活检术是临床诊断肿瘤细胞是否转移淋巴结的常用方法。但临床使用的淋巴结显影剂亚甲蓝有赖于手术医师术中寻找蓝染淋巴管并追踪到蓝染淋巴结,切除蓝染淋巴结后,经病理检查判断是否有肿瘤细胞转移。虽然染料法过程简单、操作方便、安全性高,但由于染料分子尺寸小,易扩散到周围组织和下级淋巴结,且易受脂肪组织干扰,临床结果假阴性率较高。放射性核素胶体法,术前需用淋巴闪烁显像来确定前哨淋巴结数目和位置,术中应用γ计数器探测仪寻找“热”结节(即10 s计数值是普通淋巴结的十几倍或几十倍,蜂鸣度明显高于周围组织,为前哨淋巴结位置)并标记,取出标记处的淋巴结,经病理检查判断是否有肿瘤细胞转移。放射性核素胶体法能准确定位深埋在脂肪组织下的前哨淋巴结,但是同位素标记物会对患者及施术者造成不可避免的放射性损伤,并且该项检查操作复杂,还需要在手术室配备昂贵的医疗设备。本研究制备了近红外荧光染料Cy7标记的葡聚糖纳米胶(Dextran-Cy7),研究其作为荧光示踪剂对淋巴结的荧光成像效果,并评价了该纳米胶的毒性及其在淋巴结内的分布情况。

材 料 和 方 法

动物和试剂 葡聚糖胶(MW=10 000)由本课题组人员自行合成[1-2],荧光染料Cy7(北京泛博生物化学有限公司),Alarm blue检测液(美国Invitrogen公司),正常羊血清封闭剂、FITC标记羊抗大鼠IgG、封片剂(上海威奥公司),大鼠抗小鼠抗体CD68(美国Bio-Rad公司),紫外分光光度计(美国Varian公司),纳米粒度及电位分析仪(英国Malvern公司),透射电子显微镜(S-4800,日本Hitachi公司),荧光酶标仪(美国Thermo公司),活体荧光断层成像仪(美国VisEn公司),倒置激光共聚焦显微镜(日本Nikon公司)。小鼠树突状细胞(DC2.4细胞,上海维奥生物科技有限公司)培养基类型:RPMI-1640培养基,10%胚胎牛血清,1%双抗;培养条件:37 ℃,5% CO2。10只正常昆明小鼠,体质量20～25 g;10只C57小鼠,体质量20～25 g。每种雌雄各5只,均由同济大学动物实验中心提供。

Dextran-Cy7的制备 参考文献[1]制备巯基化葡聚糖(Dextran-SH,取代度20)。Dextran-SH与2-吡啶半胱氨盐酸盐反应过夜后得到Dex-SS-NH2[2];运用EDC法活化激活脱氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)的羟基;在室温条件下与Dex-SS-NH2反应48 h后,得到Dex-SS-DCA,其结构可通过核磁共振谱图进行分析。取Dex-SS-DCA(15 mg)和荧光染料Cy7(0.37 mg)溶于二甲基亚砜,室温避光置于摇床反应48 h后,使用截流相对分子质量3 500的透析袋避光透析、冻干后得到Dextran-Cy7粉末。

Dextran-Cy7的基本特性检测 取适量Dextran-Cy7粉末溶于磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)中,用透射电子显微镜观察其形态,用激光粒度仪检测其粒径和分布。

Dextran-Cy7载荧光染料Cy7量测定 用紫外分光光度计测定Dextran-Cy7溶液中Cy7的含量。分别配置浓度为0.375、0.75、1.5、3、6 μmol/L的Cy7溶液,以PBS为空白对照,绘制在750 nm波长下的吸光度-浓度标定曲线(Cy7在750 nm波长处有特征性吸收峰)。配置一定浓度的Dextran-Cy7在750 nm处用紫外光分光光度计检测吸光度(D)值,根据标定曲线计算Cy7的含量。

Dextran-Cy7的细胞毒性检测 使用Alarm blue 检测液测试Dextran-Cy7对树突细胞DC2.4的细胞毒性,将DC2.4细胞以10 000个/孔接种在96孔板内。37 ℃培养箱内培养24 h后,弃原液后加入浓度梯度为50、100、200、400、600、800、1 000 μg/mL的Dextran-Cy7溶液,37 ℃培养箱培养48 h后,弃原液加入200 μL/孔工作浓度的Alarm blue检测液,37 ℃培养箱培养4 h后,每孔取出180 μL转移到新的96孔板,用酶标仪检测其在570、630 nm处的D值。

Dextran-Cy7的肝肾功能毒性检测 配制浓度为5 μg/L的Dextran-Cy7溶液,按照12.5、25 mg/kg的剂量尾静脉注射入两组小鼠体内,分别喂养3和14天后处死,取肝脏和肾脏用4%甲醛溶液固定后,石蜡包埋,切片,HE染色。

小鼠淋巴结近红外荧光成像 按1 mL/kg体质量腹腔注射4%水合氯醛麻醉实验小鼠,用8%硫化钠对检查部位进行脱毛。制备2 pmol/L的 Dextran-Cy7纳米胶的生理盐溶液,小鼠左前掌垫皮下注射0.05 mL(5 mg/kg),并按摩注射部位,之后侧卧位固定于成像台,观察近红外荧光成像效果。取小鼠左侧腋窝淋巴结、腹部脂肪和右侧腋窝淋巴结,体外行近红外荧光成像。

腋窝淋巴结免疫荧光组织化学染色 小鼠前掌垫皮下注射0.05 mL的Dextran-Cy7 (2 pmol/L) 1 h后,处死小鼠,取腋窝淋巴结行OCT包埋,-80 ℃冷冻。用恒温组织切片机切片(厚度5 μm)并转移到玻片上,用4 ℃丙酮固定5 min;PBS洗涤3次,再用1%羊血清室温封闭1 h;PBS洗涤3次,滴加大鼠抗小鼠CD68抗体(标记小鼠淋巴结内巨噬细胞),放入湿盒,4 ℃过夜。第2天早上取出,室温复温30 min;PBS洗涤3次,滴加生物素化二抗,室温孵育30 min;PBS洗涤3次,DAPI染色,室温孵育5 min;PBS洗涤3次,滴加封片剂,盖玻片覆盖后干燥1 h,激光共聚焦显微镜下观察切片荧光并拍照。

结 果

Dex-SS-NH2和Dex-SS-DCA的结构解析 Dex-SS-NH2和Dex-SS-DCA的核磁共振谱图如图1所示,经谱图分析由出峰位置可知,其结构与核磁共振谱图吻合。

Dextran-Cy7纳米胶的特性 Dextran-Cy7近红外造影剂外观呈蓬松的粉末状,水溶液呈均匀淡蓝色乳液,分散度好。透射电镜显示:形态呈规则球形,表面光滑,大小较均一(图2)。经激光粒度仪检测,Dextran-Cy7的平均粒径为30～50 nm,PDI为0.12。

图1 Dex-SS-NH2和Dex-SS-DCA的核磁共振谱图Fig 1 1H NMR spectrum of Dex-SS-NH2 and Dex-SS-DCA

图2 Dextran-Cy7纳米胶的透射电镜照片Fig 2 TEM image of Dextran-Cy7 nanogel

Dextran-Cy7纳米胶的Cy7含量 Cy7在0.375～6 μmol/L范围内与D值呈良好的线性关系,得线性关系回归方程:D=186 997×Cy7 (μmol/L)+0.0007 (R2=0.999)。从而计算得到Dextran-Cy7中Cy7的含量为14.7 nmol/mg。

Dextran-CY7纳米胶的毒性 Alarm blue 检测液测试Dextran-Cy7对DC2.4细胞的毒性,发现Dextran-Cy7 (50、100、200、400、600、800、1 000 μg/mL)对细胞几乎无毒性,对细胞生存率无影响(图3)。从病理切片看,短期(3天)内Dextran-Cy7(12.5 mg/kg)并未引起小鼠肝、肾细胞形态变化,长期(14天)Dextran-Cy7(25 mg/kg)也未引起肾组织结构及细胞的变化,但是会引起肝细胞水肿变性,肝小叶结构未破坏,无溶解坏死等病理改变(图4)。

图3 Dextran-Cy7纳米胶的细胞毒性Fig 3 Cytotoxicity of Dextran-Cy7 nanogel

图4 小鼠肝脏石蜡切片照片Fig 4 Photos of paraffin sections of mouse liver

小鼠腋窝淋巴结近红外荧光成像 小鼠左前掌注射Dextran-Cy7造影剂后约30 min,运用近红外活体荧光断层成像系统观察到注射侧小鼠腋窝淋巴结显像(图5A),在荧光引导下进行定位并行淋巴结活检,进一步证实荧光显像的是小鼠腋窝淋巴结,而不是脂肪(图5B)。

图5 小鼠的活体荧光断层成像照片Fig 5 Fluorescence tomography system Image of mouse in vivo

Dextran-Cy7在淋巴结内的分布 小鼠左前掌垫皮下注射Dextran-Cy7纳米胶 1 h后,对淋巴结冰冻切片行免疫荧光染色,置于激光共聚焦显微镜下观察,可以看出 Dextran-Cy7纳米胶的荧光信号定位于巨噬细胞内(图6)。这说明Dextran-Cy7纳米胶是通过巨噬细胞吞噬富集在淋巴结内的。

讨 论

前哨淋巴结具有引流原发肿瘤细胞的特性,是原发肿瘤细胞经淋巴结转的第一站淋巴结[3-4]。目前临床将前哨淋巴结活检结果作为恶性肿瘤分期的标准之一[5]。染料法、放射性核素法以及二者联合是目前国内外外科手术中常用的前哨淋巴结显影方法[6]。虽然染料法过程简单、操作方便、安全性高,但由于染料分子尺寸小易扩散到周围组织和下级淋巴结,易受脂肪组织干扰,故临床结果假阴性率较高[7]。放射性核素法能准确定位深埋在脂肪组织内的前哨淋巴结,然而同位素标记物会对患者及施术者造成不可避免的放射性损伤,且该项检查操作复杂,还需要在手术室配备昂贵的医疗设备[5]。

图6 小鼠腋窝淋巴结荧光免疫组化的共聚焦显微照片(×60)Fig 6 Confocal micrographs of immunohistofluorescence analysis of mouse′s axillary lymph node (×60)

近年来,使用近红外荧光探针定位前哨淋巴结是热门研究[8]。近红外光谱为700～1 000 nm,在该范围人体背景荧光较弱且光散射低,能够显像深层组织,很适合活体成像[9],近红外扫描对乳腺肿块的诊断也有一定价值[10]。近红外荧光探针,如量子点(quantum dot)[10]、吲哚花菁绿(indocyanine green)[12]、七甲川花青染料(heptamethine cyanine dye)[13]等,已经被用于动物体内淋巴结成像及临床试验。但由于这些荧光染料分子粒径小,很快就流入下级淋巴结及弥散到周围组织,干扰了成像效果。此外,量子点内包含金属离子,对机体有一定的毒害作用,限制了其在临床的进一步应用。有学者将荧光探针接在生物可降解的纳米颗粒上,以此来解决荧光探针粒径小而引起的弥散问题。然而多数聚合物纳米粒径大于淋巴结成像所需粒径的最佳范围(10～50 nm),引起注射部位的长时间驻留[5]。

葡聚糖是由数个葡萄糖组成的多糖分子,具有较好的生物兼容性,在临床输血过程中可替代一部分全血,作为血浆体积的扩充剂。由于人体有较高的自发背景荧光,使用较高波长的荧光染料可减少自身荧光的干扰。Cy7是一种近红外荧光染料,激发波长为743 nm,发射波长为767 nm。本试验在自制的巯基化葡聚糖上引入疏水基脱氧胆酸,这就具备了形成纳米胶的条件,在亲水基团和疏水基团的双重作用力下自组装成纳米胶,再在葡聚糖纳米胶表面标记了能实时荧光成像的荧光探针Cy7,制备出能够用于近红外荧光成像的示踪剂。其粒径为30～50 nm,能够快速到达并较长时间驻留于前哨淋巴结处,在近红外荧光成像系统下能准确定位深层淋巴结,不受自身脂肪组织干扰,这为术前前哨淋巴结活检提供新的示踪方法。

在先前的动物毒性试验中,结果显示大剂量Dextran-Cy7对小鼠肝脏有一定的毒性,造成肝脏毒性的用药剂量(25 mg/kg)是平时成像剂量(5 mg/kg)的5倍,且由小鼠尾静脉注射,直接进入血液循环系统,更易进入肝脏血液循环,造成肝脏毒性。小鼠淋巴结的荧光免疫组化结果也显示,Dextran-Cy7主要是由巨噬细胞吞噬,肝脏内富含枯否氏细胞,可吞噬Dextran-Cy7进入包体,长期驻留在肝脏内,造成肝脏毒性。小鼠腋窝淋巴结成像时采用前掌局部注射,Dexrean-Cy7通过淋巴管的引流进入腋窝淋巴结,成像成功后处死小鼠,取出肝肾组织,近红外荧光成像离体器官,并未发现荧光信号,这可能是由于经淋巴管引流时,Dextran-Cy7进入淋巴结就会被淋巴结内的巨噬细胞所吞噬,驻留在淋巴结内,进入血液循环的较少,也就难以进入肝脏组织,故采取局部注射时其对肝脏的毒性作用有待后续进一步探讨研究。

对Dextran-Cy7活体近红外荧光成像的研究可以更早、更准确地检出前哨淋巴结是否有恶性肿瘤细胞的转移,有助于制订更合理的个体化治疗方案。今后的研究将主要围绕Dextran-Cy7的细胞吸收机制、机体内的药物动力学效应及对机体的毒性作用等方面展开;也可以为其接上新的官能团,如携带淋巴管内皮细胞的靶向分子标记物、具有治疗作用的化疗药物,从而使Dextran-Cy7成为多功能化的示踪剂。

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Mapping of mouse lymph node with near-infrared emitting dextran nanogelinvivo

LI Jie-jing1, JIANG Bei-qi1, SONG Yan-yan2, LIN Chao2, ZHUANG Zhi-gang1△

(1DepartmentofBreastSurgery,ShanghaiFirstMaternityandInfantHospital,TongjiUniversity,Shanghai200092,China;2NanoResearchInstitute,TongjiUniversity,Shanghai200082,China)

Objective To prepare and investigate a near infrared-emitting nanogel for fluorescence mapping of mouse lymph node. Methods Dextran-Cy7 nanogel was prepared by the dialysis of deoxycholic acid and Cy7-conjugated dextran in water.The morphology and particle size of the nanogel were characterized by transmit electron microscope and dynamic light scattering meter,respectively.The Cy7 content in the nanogel was determined by UV-spectrophotometer analysis.In vitro andinvivotoxicity of Dextran-Cy7 was assessed using DC2.4 cell line and C57 mouse mode,respectively.Ten Kunming mice were subcutaneously injected by the forepaw with Dextran-Cy7 and near-infrared fluorescence imaging of axillary lymph node was observed.The distribution of Dextran-Cy7 in the lymph node was detected by immunofluorescence staining. Results Dextran-CY7 nanogel showed spherical morphology with average particle size of about 30-50 nm.The nanogel has good cell compatibilityinvivoandinvitro.Dextran-CY7 nanogel may be applied as a probe for near-infrared fluorescence mapping of mouse axillary lymph node.The nanogel was found mainly in the macrophages of the lymph node. Conclusions Dextran-Cy7 nanogel is low-toxic,biocompatible and may serve as a fluorescence tracer forinvivofluorescence imaging of lymph node.

lymph node mapping; near-infrared imaging; fluorescence dye Cy7; dextran; nanogel

上海市科委医学引导类项目(124119a4700); 上海市卫生局资助项目(20124164)

R 445

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.02.015

2014-06-10;编辑:段佳)

△Corresponding author E-mail:137LJJ_ZZG@tongji.edu.cn

*This work was supported by the Shanghai Science and Technology Medical Bootstrap Class Project (124119a4700),and the Shanghai Municipal Health Bureau Project (20124164).