Apelin-13通过ERK1／2信号通路促进MCF-7细胞的增殖及侵袭

彭雪微，孙丽丽，霍洪亮

（东北师范大学生命科学学院，吉林长春130024）

Apelin-13通过ERK1／2信号通路促进MCF-7细胞的增殖及侵袭

彭雪微，孙丽丽，霍洪亮

（东北师范大学生命科学学院，吉林长春130024）

采用MTT、Brdu流式细胞术，Transwell侵袭实验，ElISA、Western blot检测实验研究了apelin-13对乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭的影响.结果表明：apelin-13能够激活ERK1／2信号传导通路，上调Cyclin D1和MMP-1的表达，进而促进MCF-7细胞的增殖及侵袭，可为临床乳腺癌的诊断、防治及愈后评估提供新的思路和方法.

apelin-13；细胞外信号调节激酶1／2；细胞周期蛋白D1；基质金属蛋白酶1

1998年，Tatemoto等人［1］首次在牛胃分泌物中提取出G蛋白偶联受体APJ（putative receptor protein related to ATJ）的内源性配体，命名为apelin.迄今的研究表明，apelin是APJ唯一的天然配体.前体含77个氨基酸，可被ACE2水解成多种亚型：apelin-12，apelin-13，apelin-17，apelin-28，apelin-31，apelin-36.研究发现apelin在小鼠的肺、子宫、睾丸的主要存在形式是apelin-36，乳腺中则是apelin-13.另有研究表明，apelin与多种癌症有密切关系，能够促进癌细胞的发生、增殖、转移；apelin还可以促进癌组织中血管新生，从而加速癌细胞的增殖及转移；apelin在人的乳腺癌组织中含量高于正常组织［2］.目前apelin在乳腺癌中的作用机制仍不是十分清楚.细胞的各种生理生化反应均受到相关细胞因子的调控［3］，因此，本文重点研究了外源性apelin-13对乳腺癌MCF-7细胞的作用及其分子机制.

细胞周期蛋白cyclin D1调控细胞周期由G1期向S期过渡，cyclin D1过度表达与癌细胞增殖密切相关［4－6］.研究发现，在正常生理状态下，细胞进入S期后，cychin D1会迅速分解.细胞发生癌变时，cyclin D1蛋白高表达，使细胞周期的G1期缩短，提前进入S期，细胞异常增殖.因此，cyclin D1可能在乳腺癌发生及细胞增殖过程中起到了重要的调控作用.

基质金属蛋白酶1（metal matric proteinase，MMP-1）是一种间质胶原酶，可以特异性降解Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型胶原蛋白，破坏基底膜促进肿瘤的发生、发展.正常情况下，MMP-1的表达量很低，但是当受到佛波醇酯类、生长因子、炎性因子等刺激时，表达量显著升高.有研究表明，MMP-1在晚期乳腺癌组织中高表达，可作为预测侵润性肿瘤的标志分子［7］，抑制MMP-1的表达可明显阻碍乳腺癌细胞的侵袭及转移［8］.因此，MMP-1已成为研究乳腺癌侵袭及转移的重要靶点.

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是真核细胞内重要的信号传递途径.在哺乳动物体内共鉴定出4个MAPK亚家族，包括：C-Jun N末端激酶、应激活化蛋白激酶JNKs／SAPKs、细胞外信号调节蛋白激酶ERKs以及P38MAPK，他们之间的氨基酸序列同源性大于40%［9］.其中ERK（extracellular signal-regulated kinase）信号转导途径被认为是经典的MAPK信号转导途径.ERK在多种恶性肿瘤组织中均出现异常表达或活性增强［10－11］.因此，研究ERK信号通路与乳腺癌的关系具有十分重要的意义.

1 材料方法

1.1 试剂

DMEM培养基（美国GIBCO公司）；MTT，Tris，甘氨酸，SDS，apelin-13，ERK抑制剂PD98059（美国Sigma公司）；单克隆抗兔Phospho-p44／42ERK1／2抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；单克隆抗体鼠β-肌动蛋白和ECL蛋白印迹试剂盒（美国Santa Cruz公司）；冰醋酸、胰蛋白酶、甘油、蛋白酶抑制剂PMSF、β-巯基乙醇、溴酚蓝、二甲基亚砜（DMSO）和结晶紫（北京鼎国生物公司），青霉素-链霉素溶液-双抗（中国碧云天公司）；DEPC水、反转录PCR试剂盒、Trizol裂解液（大连宝生物公司）；人MMP-1和CyclinD1ELISA试剂盒（美国RD公司）；Transwell侵袭小室（美国Corning公司）；Brdu细胞增殖检测试剂盒（北京中昊生物科技有限公司）；脱脂奶粉、溴化乙啶EB（长春尚宝生物公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒；PVDF膜（Millipore公司）.

1.2 MTT法细胞增殖检测

将200μL生长状态良好的乳腺癌MCF-7细胞（1×104个）接种到96孔板中，加含10%胎牛血清的DMEM培养基培养12h；小心吸弃上清，按180μL／孔加入新鲜无血清培养基饥饿12h；加apelin-13（0.01，0.1，10μmol／L）刺激细胞24h或10μmol／L apelin-13和10μmol／L PD98059抑制剂；再分别向每孔加入20μL MTT溶液（终质量浓度为0.5mg／mL），继续孵育4h；小心吸弃上清，每孔加DMSO 150μL，震荡10min，使孔中残留的MTT-甲臜结晶充分溶解，采用终点法酶标仪检测D（490）值.每组实验5次重复，以保证实验数据的准确性.

1.3 Brdu流式细胞术

将2mL生长状态良好的MCF-7细胞（1×106个）接种到6孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基培养24h；小心吸弃上清，按2mL／孔加入新鲜无血清培养基饥饿12h；apelin-13（0.01，0.1，10μmol／L）刺激细胞12h，根据Brdu细胞增殖检测试剂盒说明使用流式细胞仪检测细胞增殖率.

1.4 Transwell侵袭实验

将MCF-7细胞撤血清饥饿12h，用胰蛋白酶消化细胞，制备细胞悬液，以2×105个／mL的浓度接种于含有apelin-13（0.01，0.1，10μmol／L）或apelin-13和PD98059（均为10μmol／L）底部铺有基质胶的Transwell上室（小孔直径8.0μm），24孔板下室中加入含有10%胎牛血清的培养基，在37℃、含5% CO2的培养箱中培养12h.用棉球擦除聚碳酸酯膜的上部细胞，用10%甲醇溶液固定聚碳酸酯膜下部的细胞30s，之后用0.1%结晶紫室温染色20min.将内置小室正置于载玻片上，倒置显微镜下随机选取3个视野显微拍照.按0.1mL／孔加入33%醋酸脱色，震荡，使用酶标仪检测D（570）值.

1.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）

收集细胞培养上清液或裂解液，3 000r／min离心10min，取上清液，－20℃保存备用；从4℃冰箱中取出ELISA试剂盒室温平衡20min，37℃水浴锅中加热溶解试剂盒中的浓缩洗涤液，并用蒸馏水按照1∶20的比例（体积比）稀释；设置标准品孔和样本孔，向包被待测抗体的微孔中一次加入样本、标准品、辣根过氧化物酶标记的检测抗体；封口膜封口，37℃温浴1h；用洗涤液洗涤5次，1min／次；彻底洗涤之后加入TMB，37℃避光温浴15min显色（TMB能够在过氧化物酶的作用下变成蓝色、在酸的作用下转变成最后的黄色），颜色的深浅和样品中的蛋白量呈正相关.加入终止液之后在酶标仪上使用终点法检测D（450）值.根据标准品的浓度梯度曲线计算样品浓度.

1.6 Western blot检测实验

将培养的细胞经预冷的PBS（0.01mol／L，pH＝7.2～7.3）漂洗2次.吸净PBS，加入预冷的1mL RIPA裂解液，RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制剂PMSF（终浓度1mmol／L）.用细胞刮刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液转移至预冷的离心管中，冰上裂解30min.将超声探头没入混悬液内，超声破碎2min，破碎分4次进行，每次30s.4℃条件下12 000r／min离心10min.轻轻吸取上清，转移至新的离心管中，置于冰上，吸取的上清即为提取蛋白；弃沉淀，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定浓度.为确保每个蛋白样品上样量的一致性，－20℃保存备用；测定前，100℃或沸水浴加热3～5min，以充分变性蛋白.SDSPAGE电泳分离目的蛋白，根据蛋白的相对分子质量标准切割凝胶并将胶上的蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1h.一抗4℃孵育过夜，二抗37℃孵育60min.ECL检测试剂盒曝光.

1.7 数据分析

实验数据以平均数±标准差表示，应用Sigma plot10.0软件统计数据.统计学分析采用样本平均数t检验进行各组间数值的比较，P＜0.05为差异显著.

2 实验结果

2.1 Apelin-13促进MCF-7细胞增殖和侵袭

Apelin-13刺激MCF-7细胞24h后检测D（490）值.结果显示，随着apelin-13浓度的升高，D（490）值随之增大，10μmol／L apelin-13刺激组D（490）值最大（见图1A）.Brdu标记的细胞增殖实验结果显示，与对照组比较，apelin-13刺激组细胞的增殖率明显提高（见图1B）.Transwell侵袭小室检测apelin-13促MCF-7细胞的侵润作用：用不同浓度的apelin-13刺激MCF-7细胞6h，结晶紫染色.与对照组相比，apelin-13刺激组着色面积明显升高，且随着apelin-13浓度的升高着色程度逐渐加深.说明进入小室下室的细胞数量增多（见图1C）.再收集小室下室的细胞，检测D（570）值，结果与侵袭小室实验中各组结果一致，随着Apelin-13浓度的增加，D（570）值随之增大（见图1D）.细胞增殖和侵袭时cyclin D1和MMP-1基因异常活跃.因此，我们用ELISA检测了apelin-13刺激MCF-7细胞后增殖基因cyclin D1和MMP-1的蛋白表达.结果显示，cyclin D1和MMP-1的表达与apelin-13浓度呈正相关（见图1E，F）.

图1 Apelin-13促进MCF-7细胞增殖和侵袭结果

2.2 ERK1／2信号通路调控apelin-13诱导的细胞增殖和侵袭

为了确定apelin-13促进MCF-7细胞增殖及侵袭所依赖的信号途径，我们检测了apelin-13刺激组MCF-7细胞ERK1／2的磷酸化水平.Western blot结果显示，ERK1／2磷酸化水平与apelin-13刺激浓度呈正相关，10μmol／L apelin-13刺激组ERK1／2磷酸化达到了显著水平（见图2A）.apelin-13孵育MCF-7细胞12h后，再用10μmol／L ERK1／2抑制剂PD98059处理MCF-7细胞1h，ERK1／2磷酸化水平明显降低，表明PD98059能够阻断ERK信号通路（见图2B）.

大量研究表明，ERK1／2调控异常与肿瘤的发生、发展关系密切.上述结果证明，外源性apelin-13能够激活ERK1／2的表达，apelin-13可能通过激活ERK1／2信号通路促进MCF-7细胞的增殖及侵袭.因此，我们用PD98059预处理MCF-7细胞1h，利用MTT检测细胞的增殖情况.结果显示，apelin-13刺激组D（570）值明显高于对照组，而PD98059处理组D（570）值均有明显降低，且略低于对照组（见图2C）.说明apelin-13对MCF-7细胞的促增殖作用被PD98059所抑制.Transwell侵袭实验结果显示，apelin-13刺激组结晶紫着色面积明显高于对照组，侵入到下室的细胞数量增加；PD98059处理后，结晶紫着色面积减少，侵入到下室的细胞数量明显减少（见图2D）.ELISA结果显示，PD98059能够抑制cyclin D1和MMP-1的表达，使cyclin D1和MMP-1表达与对照组表达量几乎一致（见图2E，F）.

图2 Apelin-13通过ERK1／2信号通路调控MCF-7细胞的增殖及侵袭

3 讨论

近年来，大量实验数据表明内源性配体apelin在人体恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥重要的作用.如apelin在人体结肠癌中过量表达，可促进结肠癌的发展［12］.现已发现apelin在乳腺组织和乳汁中含量较高，在人乳腺癌细胞系MCF-7中也有高水平表达.但是，apelin对乳腺癌发生的作用机制还没有明确结论，为此，我们做了大量实验检测外源性apelin-13对乳腺癌细胞MCF-7增殖和侵袭的影响.

不同浓度的apelin-13能够促进MCF-7细胞的增殖（见图1A，B）及侵袭（见图1C，D）.同时，能上调cyclin D1（见图1E）及MMP-1（见图1F）的表达且具有浓度依赖性，10μmol／L apelin-13刺激组cyclin D1和MMP-1蛋白表达增加量最为明显.在细胞周期中，cyclin D1过度表达则会缩短G1期间隔，降低细胞对促细胞分裂剂的依赖性，从而促进肿瘤的发生和发展.MMP-1能够刺激肿瘤细胞的侵袭和分化，抑制肿瘤细胞的凋亡，从而促进肿瘤的发生和转移.为了进一步研究apelin-13促进MCF-7增殖及侵袭的分子机制，我们应用ERK1／2抑制剂PD98059，检测了ERK1／2与apelin-13刺激MCF-7细胞增殖及侵袭的关系.结果表明，PD98059能够明显抑制apelin-13诱导的MCF-7细胞增殖和cyclin D1的高水平表达（见图2C，E）.说明ERK1／2在apelin-13诱导MCF-7细胞增殖周期中起到了重要的调控作用.同样，PD98059也能够明显抑制apelin-13诱导的MCF-7细胞侵袭及MMP-1的表达（见图2D，F）.Western blot结果进一步证实apelin-13刺激后ERK1／2磷酸化水平升高，apelin-13能够激活ERK1／2信号传导通路（见图A，B）.因此，apelin-13可能是通过激活ERK1／2信号通路促进MCF-7细胞增殖及侵袭的.

综合以上结果，apelin-13激活ERK1／2作用于相关转录因子和蛋白激酶等多种底物进入细胞核，调节cyclin D1，MMP-1等相关基因的转录，进而参与MCF-7细胞生长、增殖、侵袭及转移等多种生理过程，这一机制的阐明可为乳腺癌的治疗及预防提供新方向.

［1］ TATEMOTO K，HASOYA M，HABATA Y，et al.Isolation and characterization of a novel endogenous peptide ligand for the human APJ receptor［J］.Biochem Biophys Res Commum，1998，251：471-476.

［2］ WANG Z，GREELEY GH JR，QIU S，et al.Immunohistochemical localization of apelin in human normal breast and breast carcinoma［J］.J Mol Histol，2008，39（1）：121-124.

［3］ 李文蕾，孙丽丽，霍洪亮.内脂素对心肌细胞ICAM-1和VCAM-1及相关因子的影响［J］.东北师大学报：自然科学版，2013，45（1）：113-116.

［4］ NOH J H，JUNG K H，KIM J K，et al.Aberrant regulation of HDAC2mediates proliferation of hepatocellular carcinoma cells by deregulating expression of G1／S cell cycle proteins［J］.PLOS One，2011，6（11）：28103.

［5］ JUNG K H，NOH J H，KIM J K，et al.HDAC2overexpression confers oncogenic potential to human lung cancer cells by deregulating expression of apoptosis and cell cycle proteins［J］.J Cell Biochem，2012，113（6）：2167-2177.

［6］ PANG M，MA L，LIU N，et al.Histone deacetylase 1／2mediates proliferation of renal interstitial fibroblasts and expression of cell cycle proteins［J］.J Cell Biochem，2011，112（8）：2138-2148.

［7］ POOLA I，DEWITTY R L，MARSHALLECK J J，et al.Identification of MMP-1as a putative breast cancer predictive marker by global gene expression analysis［J］.Nat Med，2005，11：481-483.

［8］ RIDER L，OLADIMEJI P，DIAKONOVA M.PAK1regulates breast cancer cell invasion through secretion of matrix metalloproteinases in response to prolactin and three-dimensional collagen IV［J］.Mol Endocrinol，2013，27（7）：1048-1064.

［9］ DAVIS R J.Signal transduction by the JNK group of MAP kinases［J］.Cell，2000，103：239-252.

［10］ LI L，LI L，XIE F，et al.Jagged-1／Notch3signaling transduction pathway is involved in apelin-13-induced vascular smooth muscle cells proliferation［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2013，45（10）：875-81.

［11］ QIN D，ZHENG X X，JIANG Y R.Apelin-13induces proliferation，migration，and collagen I mRNA expression in human RPE cells viaPI3K／Akt and MEK／Erk signaling pathways［J］.Mol Vis，2013，19：2227-2236.

［12］ PICAULT F X，CHAVES-ALMAGRO C，PROJETTI F，et al.Tumour co-expression of apelin and its receptor is the basis of an autocrine loop involved in the growth of colon adenocarcinomas［J］.Eur J Cancer，2014，50：663-674.

The effect of apelin-13on breast MCF-7cell proliferation and invasion via activate ERK1／2signaling pathways

PENG Xue-wei，SUN Li-li，HUO Hong-liang
（School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China）

This papers researched the effect of apelin-13on breast MCF-7cell proliferation and invasion through MTT，Brdu flow cytometry assay，Transwell assay，Elisa，Western Blot.These results showed that apelin-13could increase cyclin D1and MMP-1and induce MCF-7cells proliferation and migration via activate ERK1／2signaling pathways.

apelin-13；ERK1／2；cyclin D1；MMP-1

Q 253 ［学科代码］ 180·2130

A

（责任编辑：方 林）

2015-01-27

国家自然科学基金资助项目（51478096）；吉林省重点科技攻关项目（20140204059YY）.

彭雪微（1989—），女，硕士研究生；通讯作者：霍洪亮（1963—），男，博士，副教授，主要从事细胞生理学研究.