拟黑多刺蚁hsp90基因的RNA干扰及其对EcR和USP基因mRNA表达的影响

樊瑾瑛，应琼琼，党 亮，奚耕思

(陕西师范大学 生命科学学院，动物生殖与发育实验室，陕西 西安710062)

拟黑多刺蚁hsp90基因的RNA干扰及其对EcR和USP基因mRNA表达的影响

樊瑾瑛，应琼琼，党 亮，奚耕思

(陕西师范大学 生命科学学院，动物生殖与发育实验室，陕西 西安710062)

【目的】 对拟黑多刺蚁(PolyrhachisvicinaRoger)成虫热激蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)基因进行RNA干扰(RNAi)，为分析hsp90基因的功能及将RNAi技术用于害虫防治提供参考。【方法】 采用Trizol法提取拟黑多刺蚁总RNA，反转录合成cDNA第一链用于hsp90基因的克隆。利用 T7 RiboMAXTMExpress RNAi System将hsp90合成双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)，将其配制成120，60，30，15和7.5 ng/μL的溶液饲喂拟黑多刺蚁雌蚁、雄蚁和工蚁成虫进行RNAi，共饲喂14 d，记录成虫死亡率，确定dsRNA最适质量浓度，并以此剂量对各品级成虫进行干扰，通过荧光实时定量PCR，检测干扰效果及干扰hsp90基因对EcR、USPmRNA表达的影响。【结果】 成功获得拟黑多刺蚁hsp90基因片段，其长度523 bp，并合成了dsRNA。饲喂dsRNA后发现，dsRNA质量浓度越大， 拟黑多刺蚁死亡率越高，在dsRNA质量浓度为120 ng/μL时，饲喂5 d后成虫全部死亡；30 ng/μL是dsRNA干扰的最适质量浓度。以30 ng/μL dsRNA干扰后，荧光实时定量PCR结果表明，拟黑多刺蚁每个品级成虫hsp90基因mRNA均被沉默。hsp90基因被干扰后，EcR的表达没有显著变化，USP的表达显著降低。【结论】 采用饲喂法成功干扰了拟黑多刺蚁hsp90基因mRNA的表达；hsp90基因与USP基因表达有一定的相关性。

热激蛋白90基因；RNA干扰；蜕皮激素受体；超气孔蛋白

热激蛋白(Heat shock protein,HSP)最早是由Ritossa在果蝇的粗线染色体上发现的。热激蛋白是一类应激蛋白，当生物体处于高温、低氧或紫外线照射等条件下，其表达量都会急剧增加[1-2]。热激蛋白主要有5类：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60及小分子sHSP[3-4]。昆虫体内的热激蛋白不仅与昆虫的耐热性有关，还与昆虫的发育有重要的关系[5]。Huang等[3]克隆了斑潜蝇的3种小分子hsp(hsp19.5、hsp20.8和hsp21.7)和2种hsp60(TCP1A、TCP1F)基因,发现其总的表达趋势是:小分子hsp在蛹期表达量最高,而大分子hsp60的表达量则随着生长发育的进行而递增,说明热激蛋白不仅与生长发育相关，还参与了昆虫的变态行为。用注射法干扰赤拟谷盗第6龄期幼虫体内的hsp90基因后，这些幼虫的发育将停留在蛹前阶段，不能形成正常的复眼[6]。

对果蝇的研究证明，HSP70和HSP90参与了蜕皮激素信号转导[7-8]。在果蝇蜕皮激素信号转导中，HSP70、HSP90及钙调蛋白同源域64(Calponin homology domain64，Chd64)等辅助因子与蜕皮激素受体(Estrogen receptor-related receptor,EcR)和超气孔蛋白(Ultraspiracle Protein，USP)形成的异源二聚体相互作用，从而激活EcR/USP和DNA的结合活性，HSP90对于蜕皮激素受体的激活具有必不可少的作用[4,9]。

RNA干扰(RNAi)指将双链RNA(dsRNA)导入细胞后，引起与dsRNA互补的内源性mRNA特异性降解，导致此mRNA编码的基因不表达，发生基因沉默的现象[10]。昆虫RNAi的研究发展迅速，技术也日趋成熟。将dsRNA导入昆虫的方法主要有注射法、饲喂法以及组织培养法等[11]，其中饲喂法是目前应用较多一种方法，此种方法通过饲喂能够表达dsRNA的菌株或人工饲料，使昆虫连续摄入dsRNA，从而达到有效抑制靶基因表达的目的[12]。这种方法在多种昆虫中被证明是可行的[13]。

HSP90参与昆虫由蜕皮激素介导的信号通路，关于这方面的研究仅在果蝇、棉铃虫等少数昆虫中有报道[7，9]，而对于具有品级分化的社会性昆虫拟黑多刺蚁，HSP90是否与EcR和USP存在相关性，还未见有报道。鉴于此，本试验采用dsRNA饲喂方法，对拟黑多刺蚁3个品级成虫进行hsp90基因表达干扰，确定最适dsRNA干扰量，并利用荧光实时定量PCR方法，分析dsRNA对各品级成虫hsp90、EcR和USP基因mRNA水平表达量的影响，以期深入了解hsp90基因的功能，同时为将RNAi应用于害虫防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试昆虫 拟黑多刺蚁购自浙江温州瑞丰蚂蚁工坊。购回后，在实验室内以新鲜肉类、瓜果、蜂蜜以及冰糖等进行人工喂养，饲养温度为18～35 ℃，湿度为30%～40%。

1.1.2 主要试剂 Trizol 试剂、 SuperScriptTMFirs-t Strand Synthesis试剂盒，Taq酶、dNTP均购自Takara公司;T7 RiboMAXTMExpress RNAi System由Promega公司提供;琼脂糖DNA凝胶回收试剂盒，购自百泰克生物技术有限公司;ABITaqMan2@PCR MasterMix，为美国ABI公司产品。

1.2 方 法

1.2.1hsp90基因片段的克隆 取拟黑多刺蚁工蚁5～6只，按照Trizol试剂的使用说明提取总RNA，用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的纯度和浓度。将检测合格的RNA用反转试剂盒反转为第一链cDNA。根据陕西师范大学动物生殖与发育实验室克隆得到的拟黑多刺蚁hsp90基因序列(GenBank序列号为JN100104.1)，用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，上游引物(5′→3′)为：AGGTCGCCAACAGTTCATTC，下游引物(5′→3′)为：CCAGACGACAAAGAGCAGT，送至南京金斯瑞公司进行合成。以cDNA为模板，进行PCR扩增，反应体系：模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2×PCR mix 5 μL，无菌水2 μL。反应程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 45 s,65 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,10个循环； 95 ℃ 45 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min, 25个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用琼脂糖DNA凝胶回收试剂盒回收，将回收片段送往南京金斯瑞公司测序，测序结果在NCBI中进行BLAST比对。在上下游引物的5′端加上T7启动子(TAATACGACTCACTATAGG)，再次进行PCR扩增及产物电泳、回收、测序(方法同前)。

1.2.2 dsRNA的合成 参照T7 RiboMAXTMExpress RNAi System试剂盒说明书合成dsRNA，将dsRNA在室温下不作处理放置不同时间段(0,2，4和6 h)后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测其在常温下的稳定性，并用UVP紫外凝胶成像系统观察目的条带长度是否符合要求。电泳条件：2 μL dsRNA原液+2 μL 6×loading buffer混匀后上样，电压120 V，时间15～20 min。取2 μL dsRNA原液，与 48 μL 0.1% DEPC处理水混匀，紫外分光光度计检测其浓度及纯度。最后将dsRNA于-20 ℃保存，备用。

1.2.3 拟黑多刺蚁的dsRNA喂食 随机选取同一批次内发育良好的30～40只不同品级的拟黑多刺蚁成虫(工蚁、雄蚁、雌蚁)用于试验。用灭菌的DEPC水将合成的dsRNA分别稀释成120，60，30，15与7.5 ng/μL的溶液饲喂拟黑多刺蚁成虫。以仅喂食灭菌DEPC水的各品级拟黑多刺蚁成虫作为对照。连续喂食14 d，每天记录不同质量浓度dsRNA处理成虫的死亡数目。最后统计整个饲喂过程的累计死亡率。为保证试验的准确性，每个浓度重复3次喂养。

1.2.4 RNAi效应检测 分别设计目的基因hsp、EcR、USP实时定量引物和内参基因β-actin特异性引物，引物序列如表1所示。

随机取用6～8只30 ng/μL dsRNA饲喂的拟黑多刺蚁，提取其总RNA，反转录得到cDNA，进行荧光实时定量PCR，检测hsp90基因mRNA的表达变化。荧光实时定量PCR在StepOneTM荧光定量PCR仪(美国ABI公司)上进行，每个样本重复3次，设置不含cDNA模板的空白对照。最终结果采用2-ΔΔCt法进行计算，使用SPSS 16.0软件进行统计学分析，并用单因素方差进行差异显著性分析(P<0.05)。

表1 拟黑多刺蚁hsp90、EcR、USP及β-actin基因的荧光实时定量PCR引物Table 1 Primers used for expression analysis of hsp90，EcR，USP and β-actin in P.vicina

2 结果与分析

2.1 拟黑多刺蚁hsp90的克隆及dsRNA合成

2.1.1hsp90的克隆 提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳检测，出现28S、18S和5S 3条带(图1)，表明RNA的完整性较好；经紫外分光光度计检测，OD260/OD280为1.8～2.0，表明RNA的纯度符合要求，可以用于后续试验。用特异性引物扩增得到523 bp的拟黑多刺蚁hsp90片段(图2)；经纯化试剂盒纯化后，送南京金斯瑞公司测序，经BLAST比对发现，扩增片段与目的片段相似性达95%以上，说明得到了目的基因片段。在上、下游引物的5′端加上T7启动子后，扩增得到了两端带有T7启动子序列的目的基因片段(图2)，表明启动子成功添加，扩增所得产物可以用于dsRNA的合成。

图1 拟黑多刺蚁总RNA的凝胶电泳图
M.DL2000 DNA Marker;1.总RNA
Fig.1 Total RNA ofP.vicina
M.DL2000 DNA Marker;1.Total RNA

2.1.2 dsRNA的合成 由图3可知，体外合成获得了523 bp的dsRNA，其在常温下放置未发生降解。经紫外分光光度计检测，OD260/OD280为1.8～2.0，表明dsRNA的纯度符合要求，可以用于后续试验。

图2 拟黑多刺蚁hsp90的PCR扩增结果M.DL2000 DNA Marker;1.引物5′端未添加T7启动子扩增片段;2.引物5′端添加T7启动子后扩增片段Fig.2 Amplification of hsp90 gene segments of P.vicina through RT-PCR M.DL2000 DNA Marker;1.Amplified fragments before without addition of the promoter;2.Amplified fragments in primer 5′ end add T7 promoter

2.2 饲喂dsRNA对拟黑多刺蚁死亡率的影响

饲喂不同质量浓度dsRNA后，拟黑多刺蚁的死亡率见图4。图4结果表明，拟黑多刺蚁死亡率随着dsRNA质量浓度的增大而升高。120 ng/μL dsRNA喂食5 d试虫全部死亡；60 ng/μL dsRNA可导致拟黑多刺蚁成虫大量死亡，而15和7.5 ng/μL dsRNA对拟黑多刺蚁的死亡率影响较小，因此选用30 ng/μL作为dsRNA干扰拟黑多刺蚁hsp90基因的最佳质量浓度。

2.3 RNAi对拟黑多刺蚁hsp90 mRNA表达的影响

用dsRNA喂食之后，拟黑多刺蚁的各个品级成虫的hsp90基因在mRNA水平上的表达均显著降低，且以雌蚁最为明显，其hsp90基因的表达下降了76%；雄蚁hsp90表达下降了24.4%；工蚁hsp90的表达下降了31.1%(图5)。

图5 RNA干扰对拟黑多刺蚁成虫hsp90基因mRNA表达的影响*表示与对照相比差异显著(P<0.05)。图7同
Fig.5 Effect on the expression ofhsp90 gene mRNA inP.vicinaafter RNA interference *Represents significant difference atP<0.05 level. The same as Fig.7

2.4 RNA干扰拟黑多刺蚁成虫hsp90后对EcR和USP mRNA表达的影响

2.4.1 对EcRmRNA表达水平的影响 如图6所示，hsp90被干扰之后，拟黑多刺蚁所有品级成虫EcR基因mRNA的表达水平均有一定变化，但差异未达到显著水平(P>0.05)。由此说明，hsp90表达下调对EcR的表达没有显著影响。

2.4.2 对USPmRNA表达水平的影响 如图7所示，当hsp90被干扰之后，拟黑多刺蚁所有品级成虫USP基因表达均显著下调(P<0.05)，其中以雄蚁的下调最为明显，其USP基因表达降低了84.6%；其次是工蚁，降低了81%；雌蚁降幅最小，为50.3%(图7)。

图6 RNA干扰拟黑多刺蚁hsp90基因对EcR基因mRNA表达的影响
Fig.6 Expression ofEcRmRNA whenhsp90 ofP.vicinawas interfered by feeding dsRNA

图7 RNA干扰拟黑多刺蚁hsp90基因对USPmRNA表达水平的影响
Fig.7 Expression ofUSPmRNA whenhsp90 ofP.vicinawas interfered by feeding dsRNA

3 讨 论

HSP90是一类很重要的伴侣蛋白，它与许多重要信号蛋白的构象成熟有关，但是人们对它们相互之间的识别机制并不清楚[14]。对绿头蝇的研究显示，在其化蛹前hsp90的表达会突然增加。蜕皮激素可促进蛹的形成，因此hsp90表达的增加可能是被蜕皮激素所诱导的[15]。研究表明，Hsp90对于果蝇体内蜕皮激素活性的提高是必需的[7]。在棉铃虫的表皮细胞系中发现，用dsRNA干扰hsp70基因的结果与敲除EcR和USP后的结果类似，而干扰hsp90后，会导致USP1、E75BP以及HR3表达下调，而这些基因均为20E相关基因，证明hsp90参与了20E信号通路;同时还发现,敲除hsp90基因后，可以导致JH通路上的kr-h1表达下调，表明hsp90也参与了JH信号通路，因此hsp90可能是20E和JH通路形成“交叉互作”的一个重要基因[9]。

RNAi是一种转录后基因沉默技术。目前,RNAi已在基因功能决定、基因敲除、癌症治疗以及抗病毒药物开发等多个领域广泛应用[10]。近些年来，研究人员已利用RNAi阐明了多种昆虫相关基因的功能作用，而昆虫RNAi的方法主要有注射法、饲喂法和组织培养法[11]。本试验采用饲喂法进行RNAi，结果发现，30 ng/μL dsRNA是对拟黑多刺蚁hsp90进行干扰的最适质量浓度。在此质量浓度下，雌蚁hsp90基因的表达被抑制效果较好，说明干扰hsp90对雌蚁的影响更大。成功干扰hsp90基因后，EcR的表达没有显著性变化，但是USP的表达显著下调，且工蚁和雄蚁USP的表达下调较为明显。说明USP基因在成虫阶段可能与hsp90基因关系密切，其对工蚁及雄蚁生理功能有重要影响，对雌蚁影响不大。hsp90对于EcR和USP的作用与在棉铃虫和果蝇上的研究结果[6]类似，但是hsp90对USP表达的具体影响机制尚不清楚,有待进一步的研究。

本试验通过饲喂dsRNA，成功干扰了拟黑多刺蚁hsp90基因的表达，同时证实hsp90与USP基因表达有一定关联，这为研究拟黑多刺蚁其他基因的功能提供了参考，同时也为将dsRNA应用于害虫防治，进而开发新型农药提供了依据。

[1] Ritossa F A.New puffing pattern in duced by temperature shock and DNP inDrosophila[J].Experientia,1962，18(12):571-573.

[2] Lindquist S,Craig E A.The heat-shock proteins [J].Annu Rev Genet,1988,22:631-677.

[3] Huang L H,Wang C Z,Kang L.Cloning and expression of five heat shock protein genes in relation to cold hardening and development in the leafminer,Liriomyzasativa[J].Journal of Insect Physiology,2009,55:279-285.

[4] Jatuporn T,Nujira T,Tippawan S,et al.Characteristic expression of three heat shock-responsive genes during larval diapause in the bamboo borerOmphisafuscidentalis[J].Zoological Science,2008,25:321-333.

[5] Xu C S,Xiong L,Lu L D.Advance in research on effects of heat shock protein during embryo development [J].Developmental & Reproductive Biology,2000,9(1):73-82.

[6] Eileen K,Andreas V.Post-embryonic functions ofhsp90 inTriboliumcastaneuminclude the regulation of compound eye development [J].Dev Genes Evol,2013,221:357-362.

[7] Arbeitman M N,Hogness D S.Molecular chaperones activate theDrosophilaecdysonereceptor,an RXR heterodimer [J].Cell,2000,101(1):67-77.

[8] Yue L，Karr T L，Nathan D F,et al. Genetic analysis of viablehsp90 alleles reveals a critical role inDrosophilaspermatogenesis[J].Genetics,1999,151:1065-1079.

[9] Wen L,Zhang F X,Cai M J,et al.The hormone-dependent function ofhsp90 in the crosstalk between 20-hydroxyecdysone and juvenile hormone signaling pathways in insects is determined by differential phosphorylation and protein interactions [J].Biochimica et Biophysica Acta,2013,1830(11):5184-5192.

[10] 宋尔卫.RNA干扰的生物学原理与应用 [M].北京：高等教育出版社，2005:701-711

Son E W.Biological principles of RNA interference and applications [M].Beijing：Higher Education Press,2005:701-711.(in Chinese)

[11] 何正波，陈 斌，冯国忠.昆虫RNAi技术及应用 [J].昆虫知识,2009,46(4):525-532.

He Z B,Chen B，Feng G Z.Insect RNAi technology and application [J].Chinese Bulletin of Entomology,2009,46(4):525-532.(in Chinese)

[12] Hanneke H,Guy S.Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control:A review [J].Journal of Insect Physiology,2009，56(3):227-235.

[13] Turner C T,Davy M W,MacDiarmid R M.RNA interference in the light brown apple moth,Epiphyaspostvittana(Walker) induced by double-stranded RNA feeding [J].Insect Molecular Biology,2006,15(3):383-391.

[14] Pelham H R B.Speculations on the functions of the major heat shock and glucose-regulated proteins [J].Cell,1986,46(5):959-961.

[15] Tachibana S I,Numata H,Goto S G.Gene expression of heat-shock proteins (Hsp23,Hsp70 and Hsp90) during and after larval diapause in the blow flyLuciliasericata[J].Journal of Insect Physiology,2005,51:641-647.

RNA interference effect ofhsp90 gene and impacting on the mRNA expression ofEcRandUSPgenes inPolyrhachisvicinaRoger

FAN Jin-ying,YING Qiong-qiong,DANG Liang,XI Geng-si

(LaboratoryofAnimalReproductionandDevelopment,CollegeofLifeScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an,Shaanxi710062,China)

【Objective】 This paper involve the function ofhsp90 gene inPolyrhachisvicinaRoger by using RNA interference technology,and provide the reference for the prevention and control of pests.【Method】 The total RNA was extracted by Trizol,reverse transcription synthetic cDNA first chain used for hsp90 gene cloning,double strand RNA (dsRNA) ofhsp90 gene was synthesized by T7 RiboMAXTMExpress RNAi System and the ants including female,male and wokers were fed by dsRNA at 120,60,30,15 and 7.5 ng/μL in 14 days.The adult mortalities were recorded,the most suitable dsRNA concentration was confirmed,and all grade of adults was taken by this dose interferece.The interference effect and interferencehsp90 gene effectingEcRas well asUSPmRNA expression was detected by fluorescent real-time quantitative RT-PCR.【Result】P.vicinahsp90 dsRNA was gotten by the synthesis according tohsp90 gene of fragment length 523 bp dsRNA was fed toP.vicinaants,the mortality increased along with the increased dsRNA concentration,P.vicinaants were all died in 120 ng/μL in 5 days.30 ng/μL maybe a appropriate choice.Under condition of 30 ng/μL,total RNA was extracted,the analysis of Florescent real-time quantitative RT-PCR indicates hsp90 mRNA ofP.vicinaants were suppressed in all grades.There are no significant change in the expression ofEcRmRNA ofP.vicinaand an obovious decrease of USP mRNA ofP.vicinaafter interferinghsp90.【Conclusion】 The interference ofhsp90 has been achived successfully as firstly,and preliminary analyze indicates that a correlation may be exited betweenhsp90 and USP.

heat shock protein 90 gene;RNA interference; ecdysone receptor;ultraspiracle protein

2013-10-22

国家自然科学基金面上项目(31171195)

樊瑾瑛(1988-)，女，陕西渭南人，在读硕士，主要从事动物生殖和发育研究。E-mail:fjy933@126.com

奚耕思(1956-)，女，上海浦东人，教授，博士生导师，主要从事动物生殖和发育研究。E-mail:xigengsi@snnu.edu.cn

时间:2015-03-12 14:17

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.04.017

Q966

A

1671-9387(2015)04-0191-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150312.1417.017.html