海因改性N-季铵化壳聚糖衍生物的合成及其抗菌性能

陈燕燕，李明春，辛梅华，林意华

（华侨大学材料科学与工程学院，环境友好功能材料教育部工程中心，福建 厦门 361021）

壳聚糖具有生物相容性、生物降解性、抗菌活性等优良性能，被广泛用于食品工业、医药卫生、环境保护等方面[1]。在壳聚糖的各种抗菌模型中，众多学者都较倾向于氨基的作用机理，因此正电荷的引入或氨基量的增加成为壳聚糖抗菌改性的热点 之一。

季铵化改性可以引入正电性基团并且提高壳聚糖的水溶性，从而增强壳聚糖衍生物的抗菌效果。Qin 等[2]用小季铵盐与壳聚糖反应得到水溶性良好的壳聚糖季铵盐，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有一定的抗菌活性，并且在碱性环境下的抗菌活性优于弱酸环境。作者课题组[3]在合成的N,N,N-三甲基壳聚糖上引入小季铵盐得到O-(2-羟丙基三甲基氯化铵)-N,N,N-三甲基壳聚糖，抗菌结果表明，引入小季铵盐增强了N,N,N-三甲基壳聚糖的抗菌性，并且随季铵化度的增加抗菌活性增强。

海因类杀菌剂母体都是5 位被二甲基取代的五元氮杂环化合物，常将其卤化或羟甲基化后应用于抗菌方面[4]。Li 等[5]用环氧海因（GH）改性壳聚糖制备chitosan-GH，其抗菌性能优于壳聚糖。Yang等[6]通过对壳聚糖的C6-OH 改性制备6-氨基壳聚糖，抗菌结果表明，6-氨基壳聚糖与壳聚糖相比有较好的抗菌性能，是一种广谱抗菌剂。可见，氨基含量增加或正电荷的引入提高了壳聚糖的抗菌活性。因此本工作首先制备季铵化壳聚糖，进一步引入氮杂环-海因提高其抗菌性能，合成路线见图1。试验了产物的抗菌活性，考察食品添加剂乙二胺四乙酸（EDTA）对产物抗菌活性的影响，为GH- HTCC 在食品及化妆品等行业的应用提供依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器及试剂

TU-1810 紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器公司；FD-1B-50 冷冻干燥机，北京博医康实验仪器公司；VARIO EL Ⅲ元素分析仪，德国Elementa 公司；NEXUSU 470 型傅立叶变换红外光谱仪，美国Nicolet 公司；AvanceⅡ型核磁共振分析仪，瑞士Bruker 公司。

1.2 产物的合成与表征

1.2.1 环氧丙基海因和N-(2-羟丙基三甲基氯化铵)壳聚糖的制备

（1）按照文献[7]方法制备环氧海因：把3.2g的5,5-二甲基海因溶于15mL 水中，加入10mL 1%NaOH 溶液搅拌10min，滴加1.95mL 环氧氯丙烷（5,5-二甲基海因/环氧氯丙烷mol 比为1/1）于上述溶液中，室温反应10h。旋蒸去水，加入丙酮溶解产品，过滤除去沉淀的氯化钠，旋蒸得环氧海因（GH）。

（2）参照文献[2]的方法制备N-(2-羟丙基三甲基氯化铵)壳聚糖：将4.84g 壳聚糖溶于120mL 2%的乙酸溶液中，搅拌30min。27.29g 的2,3-环氧丙基三甲基氯化铵（与壳聚糖单元的摩尔比为6/1）溶于水滴加至上述溶液中，同时升温至60℃，反应24h。产品用蒸馏水透析（截留相对分子质量为8000～12000），抽滤，旋蒸，冻干，得N-(2-羟丙基三甲基氯化铵)壳聚糖（HTCC）。

1.2.2 O-羟丙基(5，5-二甲基海因)-N-(2-羟丙基三甲基氯化铵)壳聚糖的制备

参考作者课题组[8]的方法制备O-羟丙基(5,5-二甲基海因)-N-(2-羟丙基三甲基氯化铵)壳聚糖：将2.88g 的HTCC 溶于30mL 水中，滴加等质量的NaOH 溶液，60℃碱化1h。再将7.0g 环氧海因（与HTCC 单元摩尔比为3.5/1）溶于水滴至上述溶液中，60℃分别反应6h、12h 和24h。产物用蒸馏水透析，旋蒸，冻干得O-羟丙基(5，5-二甲基海因)-N-(2-羟丙基三甲基氯化铵)壳聚糖（GH-HTCC）。

1.2.3 产物的表征

采用KBr 压片，用P-E 傅里叶变换红外光谱仪测定产物的红外光谱。采用D2O 作溶剂，四甲基硅氧烷为内标，用Bruker-400 核磁共振谱仪测定产物的1H NMR。以甲醇作溶剂，DMH、GH、GH-HTCC 为溶质，配制0.01mol/L 的溶液，用TU-1810 紫外可见分光光度计测定产物在190～400 nm 的光谱吸收。通过Vario MICRO 元素分析仪进行元素分析 测试。

图1 O-羟丙基(5,5-二甲基海因)-N-(2-羟丙基三甲基氯化铵)壳聚糖的合成路线

1.3 产物的抗菌性能测试

1.3.1 培养基及样品的配制

选用LB 培养基配方如下：1% NaCl、0.5%酵母提取物和1%胰蛋白胨（配制固体培养基时，需要再加入1.5%琼脂粉），用1% NaOH 和1% HCl溶液调节培养基pH 值。样品的配制：配制2×104μg/mL 的样品水溶液。培养基和样品均在121℃高压灭菌20min。

菌种的活化：将冰箱中保存的菌种连续培养两次以上，使菌液浓度约为107～108CFU/mL，备用。

1.3.2 抑菌率的测定

参照作者课题组[3]的方法：配制pH 值7.2 含有样品质量分数为0.4%、菌液浓度约为107CFU/mL 的培养液，以不含样品的培养液为对照组，在37℃摇床中培养（E. coli 1h，S. aureus 0.5h）。取25 μL 培养液稀释，均匀涂覆在琼脂板，在37℃的培养箱中培养19～37h，观察培养皿上的细菌生长情况，根据稀释倍数算出菌落数，并计算抑菌率。实验重复3 次取平均值。抑菌率计算如式（1）

2 结果与讨论

2.1 产物的FTIR 分析

采用KBr 压片法测得产物的红外谱图如图2 和图3 所示。图2 中a 是原料5,5-二甲基海因FTIR 谱线，b 是环氧海因FTIR 谱线。由图2 可见，b 与a相比，在2926cm-1处出现环氧丙基的亚甲基的伸缩振动峰，1076cm-1、1181cm-1是环氧结构中C—O—C 的不对称伸缩振动，912cm-1是环氧对称伸缩振动，是环氧的特征峰[9]，说明DMH 已被环氧氯丙烷成功改性得到目标产物环氧丙基海因。

图2 海因和环氧海因的FTIR 图

图3 CS、HTCC 和GH-HTCC 的FTIR 图

图3 中a、b、c 分别是壳聚糖、N-(2-羟丙基三甲基氯化铵)壳聚糖和O-羟丙基(5,5-二甲基海因)-N-(2-羟丙基三甲基氯化铵)壳聚糖的FTIR 谱线。b 与a 相比，1598cm-1处NH2的伸缩振动峰消失，1568cm-1是N—H 变形振动峰，而1481cm-1处出现小分子季铵盐中CH3的C—H 不对称伸缩振动峰[[2]，说明季铵盐已接枝到壳聚糖的氨基上。c与b相比，1701cm-1和1763cm-1是海因结构中酰胺键的伸缩振动峰[10]，而2984～2875cm-1的峰形变宽，是因为亚甲基的引入，说明环氧海因已成功接枝到季铵化壳聚糖上。

2.2 产物的1H NMR 分析

以D2O 为溶剂，测得产物N-(2-羟丙基三甲基氯化铵)壳聚糖和O-羟丙基(5,5-二甲基海因)-N-(2-羟丙基三甲基氯化铵)壳聚糖的1H NMR 如图4 所示。在HTCC 的谱线中，δ 4.69 是氘代试剂的溶剂峰，δ 3.14 处为季铵盐侧链中—+N(CH3)3上H 的最大吸收峰，δ 2.71 为壳聚糖分子骨架上H2 的质子峰，δ 3.32～4.43 为H3、H4、H5 和H6、H6′的质子峰，这与文献[11]报道吻合，表明季铵盐已接枝到壳聚糖上得到目标产物。在GH-HTCC 的谱线中，δ 1.34 是羟丙基海因环上—CH3(a)上H 的最大吸收峰[10]见环氧海因已接枝到HTCC 残留羟基上，这与FTIR 的结果一致。由1H NMR 谱图进一步说明产物为目标产物GH-HTCC。

图4 HTCC 和GH-HTCC 的1H NMR 谱图

2.3 产物的UV 分析

以甲醇为溶剂，配制一定浓度的海因、环氧海因和O-羟丙基(5,5-二甲基海因)-N-(2-羟丙基三甲基氯化铵)壳聚糖的甲醇溶液，以溶剂为空白对照，在190～400nm 范围内进行扫描，测定其紫外吸收光谱如图5。海因（原料）、GH 和GH-HTCC 的最大吸收峰依次为200 nm、215 nm、209 nm，这是因为化合物结构的变化，引起海因环结构的特征吸收峰发生偏移[12]。由GH-HTCC 的紫外吸收图说明环氧海因已接枝到季铵化壳聚糖上。

2.4 产物的元素分析

图5 DMH、GH 和GH-HTCC 的UV 图

表1 产物的元素分析结果

产物的元素分析结果见表1，按作者课题组[3]的方法计算产物的取代度。由表1 可以看出，原料 CS 的脱乙酰度是83.25%，HTCC 的取代度达82.73%，考虑到壳聚糖16.75%的N-乙酰化，小季铵盐基本达到完全取代。而GH-HTCC 的取代度随着反应时间（6h、12h、24h）的增长而增加，环氧海因的取代度依次为19.56%、28.08%和35.71%，环氧海因取代度的提高增加了产物的氨基量，而氨基量的增加可以改善其对细菌的抗菌活性[6]。

2.5 产物的抗菌活性

2.5.1 产物的抑菌率

壳聚糖是天然抗菌高分子，但是只有在稀酸中溶解才能表现出其抗菌活性。而季铵盐和环氧海因改性的产物能溶于pH 值1～14 的水溶液中，扩大了使用pH 值范围。按照1.4.2 节操作测定所合成产物对革兰氏阴性菌大肠杆菌（E. coil）和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（S. aureus）的抑菌率，结果如图6 所示。可见，产物对E. coil 和S. aureus 都有一定的抗菌活性，但是对S. aureus 的抗菌效果更强，这与作者课题组[3]的研究结果一致，这可能是由两种菌种细胞壁结构的差异所致，革兰氏阴性菌细胞壁最外层脂多糖阻止大分子对其干扰。O-羟丙基(5,5-二甲基海因)-N-(2-羟丙基三甲基氯化铵)壳聚糖的抗菌活性优于N-(2-羟丙基三甲基氯化铵)壳聚糖，并且随着环氧海因取代度的提高，GH-HTCC 的抗菌活性增强。这可能是因为O 上引入的氮杂环增加了产物的氨基含量，螯合了细胞体内的金属离子、微量元素或者其他必要的营养物质，干扰细菌的正常新陈代谢，从而提高了GH-HTCC 对细菌的抗菌活性[6]。所合成的GH-HTCC1 的抗菌活性（E. coli 58.9%；S. aureus 92.6%）比chitosan-GH[5]（E. coli 3.93%; S. aureus 39.7%）的抗菌活性强，这是因为GH-HTCC 比chitosan-GH 多了一个带正电荷的季铵盐基团，能与细胞膜上所带的负电荷发生静电作用，膜的渗透性发生改变且屏障功能丧失导致细菌生长受到抑制或死亡[2]。

图6 产物HTCC 和GH-HTCC 对E. coli 和S. aureus 的抑菌率

2.5.2 EDTA 对产物抗菌活性的影响

采用平板菌落计数法测定了乙二胺四乙酸（EDTA）对E. coil 和S. aureus 的抗菌活性，结果如图7 所示，EDTA 是一种螯合剂，有一定的抗菌活性，并且随着浓度的增大其抗菌活性逐渐增强。这是因为EDTA 通过螯合能够稳固革兰氏阴性菌脂多糖和革兰氏阳性菌肽聚糖的钙离子与镁离子从而破坏细胞壁结构，且使生物体内的磷脂酶释放，进而降解质膜[13]。EDTA 对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抗菌活性优于革兰氏阴性菌大肠杆菌，这可能是因为两种菌种细胞壁结构不同所致[3]。

图7 EDTA 对E. coli 和S. aureus 的抑菌率

按照1.4.2 节的操作，试验了添加1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L 的EDTA 对N-(2-羟丙基三甲基氯化铵)壳聚糖强和O-羟丙基(5,5-二甲基海因)-N-(2-羟丙基三甲基氯化铵)壳聚糖抗菌活性的影响，结果如图8 和图9 所示。可以看出当EDTA 浓度为1mmol/L 时，EDTA 大大促进产物的抗菌活性。随着EDTA 浓度的提高产物的抗菌活性降低，甚至使HTCC 对S. aureus 的抑菌率低于未添加EDTA 的抑菌率。这可能是因为在EDTA 浓度较低时，EDTA 的螯合作用[13]和产物所带正电荷共同破坏细菌细胞膜结构[2]，提高产物的抗菌活性。而在EDTA 浓度较大时，EDTA 与产物的这种协同作用减弱，这可能是因为EDTA 除了干扰细胞膜结构和微量元素的螯合外，所含的COO-能与产物的季铵基团发生静电作用[14]，从而逐渐减弱上面所述两者的协同作用，进一步说明带正电荷的季铵基团能提高产物的抗菌活性。并且当EDTA 浓度较高时，其对GH-HTCC 抗菌性能的影响大于HTCC。这可能是因为EDTA 不仅与GH-HTCC 的季铵基团 发生作用，还与它的氮杂环发生螯合[15]，从而进一步削弱GH-HTCC 的抗菌活性，证明氨基量的多少影响到产物的抗菌活性。

图8 EDTA 对HTCC 抗菌活性的影响

图9 EDTA 对GH-HTCC 抗菌活性的影响

3 结 论

采用实验室自制的环氧海因对季铵化壳聚糖进行改性，制备O-羟丙基(5,5-二甲基海因)-N-(2-羟丙基三甲基氯化铵)壳聚糖衍生物。抗菌结果表明，引入小季铵盐增加了壳聚糖的抗菌活性，进一步引入的氮杂环也提高了HTCC 的抗菌活性。并且常用食品添加剂EDTA 影响产物的抗菌活性，低浓度的EDTA 增强了HTCC 和GH-HTCC 的抗菌活性，而高浓度的EDTA 在一定程度上抑制了二者的抗菌活性。研究结果为GH-HTCC 抗菌剂在食品等领域的应用提供依据。

致 谢

感谢华侨大学分子药物研究所刁勇老师及其学生在抗菌测试方面的大力支持和帮助。

[1] Kumar M N V R，Muzzarelli R A A，Muzzarelli C，et al. Chitosan chemistry and pharmaceutical perspectives[J].Chemical Review，2004，104：6017-6084.

[2] Qin C Q，Xiao Q，Li H，et al. Calorimetric studies of the action of chitosan-N-2-hydroxypropyl trimethyl ammonium chloride on the growth of microorganisms[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2004，34：121-126.

[3] Xu T，Xin M H，Li M C，et al.Synthesis，characteristic and antibacterial activity of N,N,N-trimethyl chitosan and its carboxymethyl derivatives[J]. Carbohydrate Polymers，2010，81：931-936.

[4] 魏文珑，温艳珍，李彦威，等. 海因类杀菌剂的研究进展[J]. 山西化工，2005，25（1）：11-14.

[5] Li R，Pei H，Ren X H，et al. Antimicrobial N-halamine modified chitosan films[J].Carbohydrate Polymers，2013，92：534-539.

[6] Yang J H，Cai J，Hu Y，et al. Preparation，characterization and antimicrobial activity of 6-amino-6-deoxychitosan[J]. Carbohydrate Polymers，2012，87：202-209.

[7] Liang J，Chen Y J，Ren X H，et al. Fabric treated with antimicrobial N-halamine epoxides[J]. Industrial Engineering Chemistry Research，2007，46：6425-6429.

[8] 毛扬帆，李明春，辛梅华，等. O-季铵化改性壳聚糖固载环糊精的制备及其载药性能[J].化工进展，2010，29（9）：1705-1709.

[9] Espinosa M H，Del Toro P J O，Silva D Z. Microstructural analysis of poly(glycidyl methacrylate) by1H and13C NMR spectroscopy[J]. Polymer，2001，42：3393-3397.

[10] Kou L，Liang J，Ren X，et al. Synthesis of a water-soluble siloxane copolymer and its application for antimicrobial coatings[J]. Industrial & Engineering Chemistry Research，2009，48：6521–6526.

[11] Cho J，Grant J，Piquette M M，et al. Synthesis and physicochemical and dynamic mechanical properties of a water-soluble chitosan derivative as a biomaterial[J]. Biomacromolecules，2006，7：2845-2855.

[12] 刘宏民. 实用有机光谱分析[M]. 郑州：郑州大学出版社，2008：14-16.

[13] Lisbeth T H，John W A，Tom A G. Antibacterial effect of protamine in combination with EDTA and refrigeration[J]. International Journal of Food Microbiology，2001，66：149-161.

[14] Chung Y C，Wang H L，Chen Y M，et al. Effect of abiotic factors on the antibacterial activity of chitosan against waterborne pathogens[J]. Bioresource Technology，2003，88：179-186.

[15] Amany A E S，Mohamed H. Chitosan-EDTA new combination is a promising candidate for treatment of bacterial and fungal infections[J]. Current Microbiology，2011，62：739-745.