解淀粉芽孢杆菌中性蛋白酶基因的克隆与表达

杜珊珊，王颖，张东杰

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

中性蛋白酶是一类在中性pH 条件下作用于蛋白质肽键的蛋白酶[1]，其能将大分子蛋白质迅速水解成肽类和部分游离氨基酸[2]，具有广泛的市场价值，被应用于纺织、医疗、皮革、食品等行业[3-4]，但中性蛋白酶产量低，成本高，发酵不稳定等，为了提高酶活性，世界各国科研工作者主要在蛋白酶基因的筛选，基因序列[5-6]，克隆表达[7]等方面进行研究。比如杨庆云等[8]用鸟枪法克隆得到嗜热脂肪芽孢杆菌的中性蛋白酶基因，该基因表达量提高了约30 倍。茆军等[9]成功克隆了高温中性蛋白酶基因，并在毕赤酵母中正确表达。

此前对中性蛋白酶的研究主要集中在蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，而对解淀粉芽孢杆菌中性蛋白酶的研究相对较少。解淀粉芽孢杆菌是一种革兰氏阳性细菌，与枯草芽孢杆菌具有很近的亲缘关系[10-11]，它具有较强的胞外酶分泌能力，是淀粉酶、蛋白酶的一些主要酶制剂的生产菌株[12]。研究以中性蛋白酶生产菌株解淀粉芽孢杆菌为研究对象，利用基因工程技术对其中性蛋白酶基因进行了克隆表达，获得了具有一定活性的中性蛋白酶。

1 材料与方法

1.1 材料

解淀粉芽孢杆菌购自中国工业菌种保藏管理中心，E.coli BL21（DE3）与质粒PET-28a 由实验室保存，Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ、T4-DNA 连接酶购于大连TaKaRa 产品，IPTG（异丙基-β-D 硫代半乳糖苷）、DNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒DNA 小提中量试剂盒购自北京博大泰克生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基配制

蛋白胨2.5 g、牛肉膏5 g、酵母膏2.5 g、葡萄糖2.5 g、氯化钠2.5 g、琼脂5 g、蒸馏水500 mL、pH7.0。将菌种放入培养基，在30 ℃培养箱中培养2～3 d[13]。

1.2.2 解淀粉芽孢杆菌总DNA 的提取

以解淀粉芽孢杆菌为材料，采用细菌基因组DNA 快速提取试剂盒，提取菌株的总DNA，并用琼脂糖凝胶电泳检测总DNA 的含量，在-20 ℃保存备用。

1.2.3 解淀粉芽孢杆菌中性蛋白酶基因的克隆

根据Gene Bank 中报道的解淀粉芽孢杆菌中性蛋白酶基因序列（登录号为：M36723.1），借助OLIGO 生物学软件设计，并在正反向引物中添加BamHⅠ和SalⅠ酶切位点，序列如下：

正向引物：CGCGGATCCGTGGGTTTAGGTAAG AAATTG

反向引物：GCGTCGACTTACAATCCGACTGCAT TCC

通过PCR 技术扩增中性蛋白酶基因，反应体系50 μL，扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃，变性40 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，35 个循环；72 ℃后再延伸10 min。将PCR 产物回收纯化后与PMD18-T Vector 进行连接，转化DH5α 感受态细胞，并涂布在Amp、X-Gal、IPTG 的固体培养基平板上，培养12～15 h 后进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落放进含氨苄的LB 液体培养基中振摇培养，送到上海生工公司进行测序，将其正确的重组质粒命名为PMD18-T-npr，并进行同源性比较。

1.2.4 重组质粒的构建

将经鉴定正确的重组质粒PMD18-T-npr 和PET-28a 分别用BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切，采用试剂盒回收纯化。将纯化后的目的片段和PET-28a置于10 μL 反应体系中进行连接，16 ℃连接12 h，过夜培养，随后将重组质粒转到E.coli BL21（DE3）中，把平板上的白斑转化子用PCR 和双酶切进行鉴定。

1.2.5 重组质粒的诱导表达

将构建成功的BL21/PET-npr 工程菌株接种于5 mL 含卡纳抗性的LB 液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜，按1%的接种量转接于新液体培养基中继续培养至OD600为0.6～0.8 h，此时加入IPTG（终浓度为1.0 mmol·L-1），37 ℃诱导4 h，以未诱导菌为对照。取适量的菌液在4 ℃8 000 r·min-1离心10 min，取上清液进行SDS-PAGE 分析，具体方法参照文献[14]。

IPTG 是一种作用极强的诱导剂，能够启动E.coli BL21（DE3）中lac 启动子的转录，但并不是IPTG 添加的越多就越好。

（1）按照上述的方法，选取不同IPTG 浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1）进行诱导，在37 ℃保温2 h 后，测得酶活力进行分析。

（2）确定最佳的诱导温度，试验以IPTG 浓度为0.8 mmol·L-1，在不同温度条件下（20 ℃、25 ℃、30℃、35 ℃、40 ℃）诱导2 h 后，对酶活力的影响。

（3）考察不同的诱导时间（1、2、3、4、5 h），其他条件固定不变（IPTG 浓度为0.8 mmol·L-1，温度在30 ℃）进行诱导，确定最佳诱导条件。

1.2.6 蛋白酶活力的测定

按照标准GBT 23527-2009，将1 mL 酶液与1%酪蛋白1 mL 混合，在pH 7.5，40 ℃条件下，每分钟反应产生1 μg 酪氨酸所需要的酶量为1 个酶活力单位（U）[15]。

2 结果与分析

2.1 PCR 扩增获得目的片段

根据所设计的引物，以解淀粉芽孢杆菌染色体DNA 为模板，进行PCR 扩增。电泳检测反应结果如图1。在1 566 bp 处可见一条与预期大小相符的特异性条带。

2.2 重组质粒的构建与鉴定

将PCR 产物和质粒PET-28a 分别用BamHⅠ和SalⅠ进行酶切，酶切产物经纯化回收后，用T4DNA连接酶16 ℃过夜连接，将其转化感受态细胞中，得到重组质粒PET-28a/npr，挑取阳性克隆并提取质粒进行双酶切验证，如图2 所示，得到一条约5 369 bp与质粒PET-28a 大小相符，和另一条1 566 bp 与目的片段大小相符，表明重组质粒构建成功。

图1 Bacillus amyloliquefaciens 中性蛋白酶基因扩增电泳图Fig.1 PCR product of npr gene in the Bacillus amyloliquefaciens

图2 重组质粒的酶切鉴定Fig.2 Enzyme identification of recombinant plasmid

2.3 目的片段的测序结果

将上述重组质粒发送到上海生工生物工程股份有限公司进行测序。得到的基因全长为1 566 bp，编码一个由522 个氨基酸组成的蛋白质，通过BLAST软件对中性蛋白酶核苷酸序列进行同源性分析，发现测序结果与Genebank（登录号：M36723.1）中解淀粉芽孢杆菌中性蛋白酶基因序列具有100%同源性。证明重组质粒PET-28a/npr 构建成功。

2.4 SDS-PAGE 检测结果

将鉴定过的阳性菌转入含有卡纳抗性的大肠杆菌中，按照试验方法对重组子进行诱导表达，离心收集上清液，根据SDS-PAGE 进行分析，结果如图3，经过诱导的重组子PET-28a/npr 出现一条明显特异性蛋白条带，分子质量约为57 kDa，该条带大小与基因序列推导的蛋白大小相符，而未经IPTG 诱导的重组蛋白和经IPTG 诱导的空载体则都未出现此条带，此说明解淀粉芽孢杆菌中性蛋白酶在大肠杆菌中得到了成功的表达。

图3 表达产物的SDS-PAGE 鉴定结果Fig.3 Identification of the expression product by SDS-PAGE

2.5 IPTG 诱导条件的优化

2.5.1 最佳诱导浓度的确定

如图4 所示，随着诱导浓度的增大，中性蛋白酶活力逐渐上升，在IPTG 浓度为0.8 mmol·L-1时酶活力达到最大，继续加大诱导浓度，酶活力反而不高。

图4 IPTG 浓度中性蛋白酶酶活力的影响Fig.4 Effects of concentration of IPTG on neutral protease enzyme activity

2.5.2 最佳诱导温度的确定

温度决定蛋白可溶性的一个重要因素，诱导温度过高容易以包涵体形式存在，温度过低酶活力降低，结果如图5 所知，随着温度的升高，在30 ℃时酶活力达到最大值，继续加热不利于酶活力。

图5 温度对中性蛋白酶酶活力的影响Fig.5 Effects of temperature on the neutral protease enzyme activity

2.5.3 最佳诱导时间的确定

如图6 所见，诱导1 h 后融合蛋白就有一定量的表达，随着诱导时间的增长，中性蛋白酶酶活力缓慢升高，诱导时间在4 h 时，酶活力达到最大，而继续诱导酶活力并没有提高，因此最佳诱导时间为4 h。

图6 诱导时间对中性蛋白酶酶活力的影响Fig.6 Effects of induction time on the neutral protease enzyme activity

2.6 表达蛋白的酶活性测定

将重组菌按照上述最佳IPTG 诱导条件进行培养，裂解细胞离心取上清液，检测其蛋白酶活性，并做空白对照试验，结果显示重组大肠杆菌阳性菌的表达产物最高酶活力达到450 U·mL-1。

3 讨论

中性蛋白酶的研究开发工作在上世纪70年代就已开始，国外最早开展基因克隆表达的有关工作，1953年Fuji[16]等从嗜热脂肪芽孢杆菌CU21 中成功克隆了中性蛋白酶基因，并将其转入另一菌株（MD-3）中进行表达，产酶量比供体菌高出15 倍。除此之外，有地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等在内的10 余种芽孢杆菌来源的蛋白酶基因得到了克隆表达。目前，商业上所用的中性蛋白酶大部分来源于芽孢杆菌属，中性蛋白酶在商品酶中占有较大的份额。因此，利用基因克隆技术提高中性蛋白酶的产量，并对其性能进行改性，为中性蛋白酶的应用具有较好的发展前景。

试验采用分子生物学方法，用PCR 扩增得到中性蛋白酶，利用表达载体PET-28a 在大肠杆菌中高效的表达。并采用SDS-PAGE 电泳进行分析，对诱导浓度、时间和温度进行优化，最高酶活性达到450 U·mL-1，在今后的试验中还将进一步分离纯化，获得的纯酶用于重组中性蛋白酶的酶学性质及其应用的研究，这将最大化提高中性蛋白酶的产量和活性，为工业生产应用具有重要的意义。

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