江苏地区犬细小病毒的分离与变异分析

甘军纪，荣燕琴，甘天喻，刘文博，王 亨，刘秀梵

（1.扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2.苏州艾贝尔宠物医院，江苏 苏州 215000）

犬细小病毒2型（CPV-2）是一种最常见的引起幼犬急性出血性肠炎的病毒，病毒直径23～26 nm，为单链DNA病毒，基因组全长大约5200 nt[1]。自从1978年世界上首次从病犬中分离到犬细小病毒（CPV-2）以来，该病毒的抗原持续变异，先后出现CPV-2a型、CPV-2b型病毒并迅速流行，完全取代了CPV-2[2]。2001年在意大利又出现了CPV-2c型病毒并快速传播到许多国家[3]。世界上不同的国家流行不同的优势CPV病毒型，如意大利、德国、西班牙以CPV-2c占优势，在英国、希腊和保加利亚CPV-2a/2b都有较高的检测频率，而在亚洲以CPV-2a为主，仅越南、中国和印度检测到CPV-2c变异株[4-6]。为了进一步了解近年来江苏地区的CPV流行情况，我们对江苏省部分地区2007-2013年病犬临床样本进行了CPV分离鉴定并对其VP2关键氨基酸的变异进行了分析。

1 材料与方法

1.1 临床样品 分别在扬州大学动物医院和苏州市某宠物医院收集CPV快速检测试剂盒检测阳性的犬粪便样品，-20℃冻存备用。

1.2 病毒分离培养 样品用0.22μm针头滤器过滤除菌，接种FK81细胞，吸附30 min，加入1%FCS-DMEM培养基继续培养。每天观察细胞病变（CPE），培养3～4 d，当80%细胞出现CPE时，收获细胞和培养液。

1.3 病毒DNA提取 CPV分离毒株和疫苗毒株分别接种FK81细胞，连传2代，收获细胞培养液，用EasyPure®Viral DNA/RNA Kit试剂盒抽提病毒DNA。

1.4 PCR扩增与NDA测序 VP2基因扩增引物设计按文献[3]，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，Hfor：5′-CAGGTGATGAATTTGCTACA-3′，Hrev：5′-CATTTGGATAAACTGGTGGT-3′。扩增预期片段630 bp（位置3556～4185 nt）。从电泳凝胶中切下目的条带，直接送上海生工生物工程技术服务有限公司进行NDA测序。

1.5 病毒分离株类型 从GenBank获取CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c参考序列。使用 DNA⁃Star软件中的MegAlign程序对所测的11个分离株和1个疫苗株VP2基因序列与GenBank获得的VP2基因序列进行比对。根据VP2蛋白6个重要信息氨基酸残基（297，300，305，324，426和440）的变化，确定变异株类型。

1.6 遗传进化分析 使用MEGA4.0对CPV分离株和参考株VP2基因序列进行多序列比对，基于邻接法（Neighbor-joining）构建系统种系发生树。

2 结果

2.1 病毒分离 2007-2013年，在扬州（YZ）和苏州（SZ）地区共获得11个CPV分离株，其中2007年1株（YZ0701L），2010年3株（YZ10-3，YZ10-4，YZ10-5），2013年 7株（YZ1311Z，YZ1311-1，YZ1311-2，YZ1312-2，SZ1301，SZ1303，SZ1305）。

2.2 VP2基因片段的PCR扩增 11个CPV分离株和1个疫苗株（CPV-F1）的细胞培养物，抽提DNA，用Hfor/Hrev为引物进行PCR，均扩增到630 bp的VP2基因产物，见图1。

图1 CPV分离毒株VP2基因片段的PCR扩增

2.3 病毒变异分析 根据VP2蛋白6个重要信息氨基酸残基（297，300，305，324，426和440）的变异分析，11个分离株中1株（SZ1303）为CPV-2，1株（YZ10-4）为CPV-2b，其余9株均为CPV-2a型，没有分离到CPV-2c。说明江苏地区犬细小病毒以CPV-2a为主要流行病毒型。此外，我们还观察到有5个CPV-2a/b分离株的VP2氨基酸发生440 Ala变异，1株CPV-2a（YZ0701L）发生300 Ser变异，疫苗毒株F1株与典型的CPV-2毒株的300 Ala不同，为300 Pro。结果见表1。

表1 CPV分离株VP2蛋白氨基酸残基变异与毒株分型

2.4 遗传进化分析 绘制的CPV VP2基因进化树见图2，大部分江苏毒株在同1个独立分支中，可能是地区环境适应的结果。

3 讨论

自从1978年世界上首次从病犬中分离到犬细小病毒（CPV-2）以来，该病毒的抗原持续变异，先后出现了CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c。CPV-2a/b/c与CPV-2有数个氨基酸的差异，其中VP2的297Ala的变异是从世界不同地区分离的CPV-2a/b/c共有的[7]；在VP2426位的氨基酸具有特别意义，CPV-2a为426 Asn ，CPV-2b为426 Asp，而CPV-2c为426 Glu，该残基位于靠近B表位的一主要抗原位点，该变化被认为影响病毒的免疫原性[3，8]。本研究中，在江苏地区分离了11个毒株，9株是CPV-2a（297Ala，426 Asn），仅1株（YZ10-4）为CPV-2b（297Ala，426 Asp），没有分离到CPV-2c，说明江苏地区以CPV-2a流行为主，这与其他地区报道的结果类似[9]，进一步证明在中国流行的CPV以CPV-2a型为主。

图2 根据VP2基因绘制的CPV进化树

本研究中，所有的CPV-2a/b分离株VP2均含有324Ile变异，这一变异于2004年左右开始出现，首先在中国和韩国检测到[9]。因为与324位氨基酸相邻的323位氨基酸的改变会影响犬转铁蛋白受体与配体的结合，从而造成犬细小病毒宿主范围的改变[9-10]，因此推测324位氨基酸突变很有可能影响到犬细小病毒的宿主范围。另外，在本研究中，有5个（50%）CPV-2a/b分离株的VP2氨基酸发生440 Ala变异，440氨基酸也位于病毒的主要抗原位点，他的改变可能导致进一步的抗原变异株的出现，近年来相同的变异已经在许多国家的CPV-2a/b发现[7，10]，也出现在CPV-2c毒株中[7]，因此，440 Ala变异的意义应重点关注。

研究表明，CPV-2a/2b宿主范围的改变可能是由VP2 蛋白的第 87L、300G（Gly）、305Y（Tyr）位氨基酸改变而引起的，我们分离的毒株绝大部分具有300 Gly、305 Tyr特征，但有1株（YZ0701L）发生300 Ser变异，国内其他研究者也发现有这种变异[11]，但这一变异的意义尚不清楚。另外，我国的疫苗毒株F1株与典型的CPV-2毒株的300Ala不同，为300 Pro，以前未见报道。VP2基因进化树分析表明，大部分江苏毒株在同1个独立分支中，可能是地区环境适应的结果。

[1] Paradiso P R，Rhode S L，Singer I I.canine parvovirus：a bio⁃chemicaland ultrastucturalcharacterization[J].J Gen Virol，1982，62：113-125.

[2]Desario C，Decaro N，Campolo M，et al.Canine parvovirus infec⁃tion：Which diagnostic test for virus[J].J Virol Methods，2005，126：179-185.

[3]Buonavoglia C，Martella V，Pratelli A，et al.Evidence for evolu⁃tion of canine parvovirus type 2 in Italy[J].J Gen Virol，2001，82：3021-3025.

[4]Nakamura M，Tohya Y，Miyazawa T，et al.A novel antigenic variant of canine parvovirus from a Vietnamese dog[J].Arch Virol，2004，149：2261-2269.

[5]张仁舟，杨松涛，冯昊，等.中国国内首次检测到犬细小病毒CPV-2c[J].中国病原生物学杂志，2010，5（4）：246-249.

[6]Decaro N，Buonavoglia C.Canine parvovirus-A review of epidemi⁃ological and diagnostic aspects，with emphasis on type 2c[J].Vet Microbiol，2012，155：1-12.

[7] Decaro N，Desario C，Parisi A，et al.Genetic analysis of canine parvovirus type 2c[J].Virology，2009，385：5-10.

[8] Decaro N，Desario C，Elia G，et al.Occurrence of severe gastroen⁃teritis in pups after canine parvovirus vaccine administration：a clinical and laboratory diagnostic dilemma[J].Vaccine，2007，25：1161-1166.

[9]Zhang R，Yang S，Zhang W，et al.Phylogenetic analysis of the VP2 gene of canine parvoviruses circulating in China[J].Virus Genes，2010，40：397-402.

[10]Mukhopadhyay H K，Matta S L，Amsaveni S，et al.Phylogenetic analysis of canine parvovirus partial VP2 gene in India[J].Virus Genes，2014，48（1）：89-95.

[11]刘大伟，杨敬，范薇，等.犬细小病毒新抗原变异株VP2基因的克隆与序列分析[J].实验动物科学，2008，25（1）：21-25.