续断片及其盐炙品高效液相指纹图谱

罗 君，卿 娟，张丽艳，张丽丽

(1.贵阳中医学院 第一附属医院，贵州 贵阳 550001；2.贵州省修文县疾病预防控制中心，贵州 贵阳550200；3.贵阳中医学院，贵州 贵阳550001)

0 引言

续断为续断科植物川续断(DipsacusasperWall.ex Henry)的干燥根，始载于《神农本草经》，现收载于《中国药典》2010版[1]；主要分布于四川、湖北、湖南、贵州等地.具有补肝肾、强筋骨、续折伤、止崩漏之功效.近年其需求量呈逐年递增趋势.目前，虽有续断药材指纹图谱[2-4]及其不同炮制方法的报道[5-6]，但仅限于药材和炮制工艺的研究；然临床上常以其酒炙和盐炙品入药，而续断片和盐续断指纹图谱研究尚未见报道.采用指纹图谱能够相对全面、整体地反映药材中化学成分的分布情况.鉴于此，我们在前期研究炮制工艺的基础上炮制10批不同产地盐续断，建立能够表征续断片和盐续断的 HPLC指纹图谱，以期为科学评价和控制续断盐炙前后饮片质量提供科学依据.

1 实验部分

1.1 仪器与试药

1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦.续断药材经贵阳中医学院魏升华副教授鉴定为续断科植物川续断的干燥根(见表1)，经测定样品中川续断皂苷Ⅵ、浸出物含量均符合《中国药典》要求.川续断皂苷Ⅵ对照品(批号为111685-201003)、绿原酸对照品(批号0753-200111)均购于中国食品药品检定研究院.乙腈，色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司；其余试剂均为分析纯.

表1 续断样品来源Tab.1 Sample source of D. asper

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理

续断片的炮制：将续断药材洗净，润透，切厚片，干燥.盐续断的炮制：分别取10批续断片，各50 g，用 2%的食盐水(2 kg食盐/100 kg续断片，食盐用4倍量水溶解)浸润2 h，140 ℃炒20 min，取出放冷，粉碎，过80目筛，即得盐续断，干燥备用.

1.2.2 对照品溶液的制备

取经五氧化二磷干燥12 h的绿原酸和川续断皂苷Ⅵ对照品适量，精密称定，用甲醇制成对照品溶液，浓度分别为0.434 0和0.151 6 g·L-1.

1.2.3 供试品溶液的制备

取续断片和盐续断各0.5 g，置100 mL具塞锥形瓶中，加入体积分数30%乙醇溶液25 mL，摇匀，密塞，称质量.超声提取(250 W，33 kHz)30 min，放冷，再称质量，用30%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过.各精密吸取滤液5 mL移至25 mL量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，滤过，滤液过0.45 μm微孔滤膜，即得续断片和盐续断供试液.

1.3 色谱条件

Agilent C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相梯度洗脱及检测波长，见表2，柱温25 ℃，流速1.0 mL· min-1，进样量10 μL.

表2 流动相梯度洗脱程序Tab.2 Gradient elution program of mobile phase

2 结果与讨论

2.1 相关实验结果

2.1.1 精密度

取续断片2号样品，按“1.2.3”项下制备供试品溶液，按“1.3”项下色谱条件连续进样6次.其共有峰的相对保留时间的RSD值小于0.11%，相对峰面积的RSD值均小于2.73%，表明仪器精密度好.

2.1.2 稳定性

取“2.1.1”项下供试液，分别于0、4、8、12、24、36 h分别进样，其共有峰的相对保留时间的RSD值小于0.23%，相对峰面积的RSD值小于4.19%.表明供试液在36 h内稳定性良好.

2.1.3 重复性

取同批续断片样品6份，按“1.2.3”项下制备供试品溶液，按“1.3”项下色谱条件进样.其共有峰的相对保留时间的RSD小于0.15%，相对峰面积的RSD值均小于4.55%，表明该方法重现性良好.

2.2 讨论

2.2.1 提取溶剂选择

实验中对亲脂性和亲水性溶剂进行考察.以氯仿、乙酸乙酯-丙酮溶剂为溶剂时，色谱峰极少，难以较全面地反映续断的内在化学成分信息.以水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇等为提取溶剂，30%乙醇溶液时色谱峰较多，峰型较好，能更好地反映续断饮片的化学信息.

2.2.2 提取方法考察

对比了回流和超声两种提取方法，结果二者色谱图基本一致，且峰面积差异不显著，从节约能源及操作便捷考虑，选择超声法提取.

2.2.3 提取时间考察

分别对15、30、45 min不同提取时间进行了比较.结果表明，30 min较15 min色谱峰峰数多，对应色谱峰的峰面积大；但45 min与30 min其色谱峰数及其对应色谱峰峰面积差异不明显，故选择30 min作为提取时间.

2.2.4 流动相系统的选择

对比了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.05%磷酸水，乙腈-0.1%磷酸水4种流动相系统，结果表明乙腈-0.05%磷酸水系统能达到较好的洗脱效果，色谱峰峰型和分离度较好，且基线平稳.

2.2.5 色谱柱的选择

考察了Hypersil C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)，Diamonsil C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)，Agilent C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)的等色谱柱.其中以Agilent C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)的分离度好，且基线平稳.

2.2.6 柱温、流速及检测波长考察

分别在25 ℃和30 ℃条件下对供试液进行了检测，结果显示30 ℃条件下部分色谱峰发生重叠，分离效果较差，故选择25 ℃作为检测温度.考察了1.0 mL·min-1及0.8 mL·min-1流速下色谱峰的分离情况，结果发现0.8 mL·min-1的色谱图与1.0 mL·min-1流速的分离效果相当，但0.8 mL·min-1会延长分离时间，故选择1.0 mL·min-1进行检测.

2.2.7 全波长扫描的三维和等高图谱

为了全面反应色谱峰信息，利用DAD检测器对供试液在190～400 nm波长范围进行采集，分析其全波长扫描的三维和等高图谱，结果显示在210 nm条件下色谱峰信息较多，但因210 nm接近末端吸收，在梯度洗脱的情况下，供试品溶液的提取溶剂会引入溶剂峰，影响样品分析，且通过分析发现在溶剂峰段样品在240 nm波长下色谱峰的响应信号更明显，无溶剂峰干扰，故采用分段波长对样品的色谱图进行采集.

2.2.8 续断片及盐续断指纹图谱特征峰的确立、指认及参照峰的选择

比较10批续断片和盐续断指纹图谱所采集数据，结果见图1和图2.

图1 10批续断片指纹图谱叠加Fig.1 HPLC overlapping chromatograms for ten batches of D. asper

由图1和图2可知，其中29个色谱峰为其共有，因此确定这29个色谱峰为续断片和盐续断指纹图谱的共有峰.在固定色谱条件下，通过对照品溶液的保留时间和紫外吸收光谱图，可以确定指纹图谱中7号峰为绿原酸，26号峰为川续断皂苷Ⅵ，见图3.川续断皂苷Ⅵ为续断的有效成分，且其在指纹图谱中峰面积较大，分离较好，出峰时间稳定，故选择川续断皂苷Ⅵ为参照峰.

图2 10批盐续断指纹图谱叠加Fig.2 HPLC overlapping chromatograms for ten batches of salt-processed of D. asper

图3续断片(S1),川续断皂苷Ⅵ(S2),绿原酸(S3)，盐续断(S4)HPLC
Fig.3HPLCchromatogramsofD.asper(S1)、asperosaponinⅥ(S2)、Chlorogenicacid(S3)andprocessed(S4)

2.2.9 相似度评价分析

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004 A版)，对10批续断片和盐续断的指纹图谱进行相似度分析(中位数法)，得10批续断片和盐续断的相似度，结果见表3.

表3 相似度分析结果Tab.3 Result of grading by similarity analysis

2.2.10 续断片聚类分析

将10批续断片指纹图谱中共有峰的峰面积利用SPSS软件进行系统聚类分析，聚类方法为组间连接，以Euclidean距离平方作为度量标准，10批样品作为变量，得到聚类分析图，见图4.相似度结果表明，10批续断片相似度存在差异，这种差异可能是样品来源本身的差异，同一省份样品差异较小，说明续断药材质量具有明显的地域性，其中以四川产续断相似度较好，一定程度上反映了川产续断的特性.

图4 续断片聚类分析图 Fig.4 Clustering analysis diagram of D.asper

2.2.11 续断盐制前后代谢轮廓差异分析

将10批续断片和盐续断样品通过主成分分析，取第一、第二主成分做得PCA打分图(见图5).

图5 续断片(1～10)和盐续断(11～20)PCA图Fig.5 Principal component analysis diagram of D.asper (1～10)and salt-processed(11～20)

图5中样品离散程度较大，说明样品间存在较大差异，此差异来源于样品本身.结合聚类分析图，发现同批次的续断片和其炮制品盐续断间基本可聚在一起，从指纹图谱“模糊性”的角度说明盐炙对续断中的化学成分影响不明显.

3 讨论

通过加权评分法综合考察了影响续断盐炙工艺的因素，盐制后较炮制前川续断皂苷Ⅵ含量和水溶性浸出物含量明显增加，绝大多数峰面积有显著变化.不同来源续断片之间化学成分组成差异不明显，但含量差异较大.

中药的药理活性表现为多种组分的协同效应，不仅与所含的有机成分有关，还与无机元素密切相关[7-8]，通过炮制前后色谱图比较，尚未发现色谱峰数目的减少与增加，同时，有学者认为Zn和Mn等是归肾经的物质基础[9]，因此，盐制续断对其功效的影响可能来自辅料本身或者是炮制品中微量元素的变化.这可能是其与有效成分发挥协同作用的原因之一，有待进一步研究.

有研究报道，除四川、湖北等省外，其他省份生产的续断含量未达到《中国药典》标准；结合本文研究结果，同一省份样品相似度差异较小，表明续断药材质量具有地域性，其中以四川产续断相似度较好；同时，我们对其含量进行了测定，均符合《药典》标准，一定程度上反映了四川产续断的特性，鉴于样品量的限制，有待进一步研究.

4 结论

本研究建立的续断片及其盐炙品高效液相指纹图谱，具有较好的专属性、重现性等特点，有利于全面、科学地控制续断片及盐续断的质量，可进一步为其质量控制提供科学依据.