温度对双眉藻生长的影响

梁文思　刘志媛

摘 要 为研究培养温度对底栖硅藻双眉藻（Amphora sp. HN08）比生长速率和脂肪、蛋白及多糖等细胞主要成分的影响，将双眉藻培养于25、30、35和38℃四 个温度条件下，6 d后测定细胞的比生长速率、总脂、可溶性蛋白和总糖的含量。结果表明：培养温度对双眉藻的生长和细胞主要成分含量有显著影响。双眉藻在38℃条件下生长最快，但总脂含量仅为细胞干重的12.9%；30和35℃培养条件下细胞油脂积累量最多，分别达到细胞干重的44.8%和44.1%；培养于20℃条件下藻细胞的可溶性蛋白和总糖含量显著高于其他处理，但细胞的比生长速率显著低于其他温度条件。

关键词 双眉藻 ；温度 ；脂 ；蛋白 ；糖

分类号 X703.1 ；S949

Abstract Effects of cultural temperature on the specific growth rate and the main components including lipids， proteins and carbohydrates in diatom Amphora sp. HN08 cells were studied. The benthic diatom was cultured under four levels of temperature： 25℃， 30℃， 35℃ and 38℃. The specific growth rate， total lipids content， total carbohydrates content and soluble protein content were determined after 6 days of culture. Our results indicated that the culture/cultural temperature had a significant influence on the growth rate and the main cell components of A sp. HN08. The maximum specific growth rate of A sp. HN08 was observed under 38℃. While total lipids content of cells cultured under 38 ℃ was only 12.9% by dry weight. 30℃ and 35℃ cultural conditions contributed to lipid accumulation， under which the lipid content reached to 44.8% and 44.1% by dry weight， respectively. The content of soluble protein and total carbohydrate in cells cultured under 20℃ were significantly higher than that under other cultural conditions， while the growth rate under 20℃ was significantly lower than that under other temperature conditions.

Keywords Amphora sp. HN08 ； temperature ； lipid ； protein ； carbohydrates

微藻是一类体积微小、结构简单、生长迅速的单细胞光合自养生物，长期以来被用作鱼、虾、贝类幼体或成体的直接或间接的活饵料。由于微藻细胞可以合成和积累一些高附加值的初级和次级代谢物，在食品、化妆品及医疗保健品等领域具有较大的开发潜力[1-2]。在能源领域，含油量高的藻种被人们认为是最有潜力的第3代生物燃料，从微藻中制取生物燃油成为近年来人们研究的热点[3-4]。

微藻感知环境和适应环境的能力较强，当环境信号改变后，细胞就会通过改变自身代谢的方式适应环境变化，自身的代谢产物也会发生相应的变化。蛋白质、碳水化物和脂是微藻光合作用的主要同化物质，其含量和比例也是评价其饵料价值或生物燃油原料潜力的重要指标之一，是微藻产品开发的重要依据。研究表明，3种碳基化合物的含量和比例受环境因子（如温度、氮、磷、硅、铁等营养盐）调控[5-11]，在生产过程中，人们可以通过调控环境因子来获得最高产量的目的产物，如油脂、蛋白或色素，同时通过微藻精炼技术收获其他高附加值的物质。因此，了解环境条件对微藻主要代谢物质的影响，是藻类开发利用的前提。

我们在海南海域分离的热带硅藻——双眉藻（Amphora sp. HN08），其含油量高（30%左右），适应性强，具有生产生物燃油的潜力；经海参养殖实验证实，该种硅藻还是糙刺参（Stichopus horrens）喜食的饵料。本研究以这株双眉藻为材料，研究不同温度条件（20、30、35及38℃）对藻细胞的油脂、可溶性蛋白和总糖3种主要同化物含量的影响，以及温度对比生长速率的影响，优化温度培养条件，为该株微藻的生产和商业化应用提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

双眉藻分离自海口市白沙门海域。以f/2培养基[12]单藻种静止培养。室温（27±2）℃，光周期为14 h∶8 h，光照4 000 lx，培养期间每天定时摇瓶3次。

取指数生长期藻液，按1∶5比例接种于3 L 玻璃三角瓶中。摇匀后分装于250 mL三角瓶中，每瓶200 mL藻液。海水取自海口市白沙门，盐度30‰，pH8.1。过滤后高压灭菌。实验设4个处理：20、30、35、38℃，每个处理3个重复。

1.2 方法

1.2.1 生长测定

双眉藻培养6 d后离心（5 000 g，Sigma 3-30K）收集，去离子水清洗一次，再次离心获得藻细胞沉淀。藻细胞冷冻干燥（Labconco）后以精密分析天平（MA200，上海良平仪器仪表有限公司）称重。据以下公式计算双眉藻的比生长速率（K）和细胞倍增时间：

K=（lnN2-lnN1）/（t2-t1）（1）

T=0.693 1/K（2）

式中，K为相对生长速率，t1、t2 为对应的培养时间（3 d），N1和N2分别为t1、t2 时期的细胞干重，T为细胞的平均倍增时间。

1.2.2 总脂、总糖和可溶性蛋白分析

细胞中的总脂用氯仿/甲醇（2/1， v/v）抽提，按照Bligh和 Dyer方法[13]测定细胞总脂含量；考马斯亮蓝染色法测定细胞中可溶性蛋白质含量[14]；硫酸蒽酮法测定细胞总糖浓度[15]。

1.2.3 统计分析

DPS数据处理系统对实验数据进行单因素方差分析[16]，采用Duncan多重比较。

2 结果与分析

2.1 温度对双眉藻生长的影响

随培养温度升高，双眉藻细胞倍增时间缩短。38℃时双眉藻生长最快，比生长率是20℃时的2.8倍。双眉藻在30和35℃时的生长速率无显著差异，均显著低于38℃的，而高于20℃的（p<0.05）。见表1。

2.2 温度对双眉藻细胞中总脂、总糖和可溶性蛋白含量的影响

30和35℃的温度条件最有利于双眉藻油脂的积累，总脂含量达到细胞干重的40%以上；38℃高温条件不利于双眉藻细胞油脂的积累，总脂含量只占细胞干重的12.9%，仅为30℃培养的藻细胞的29%，显著低于其他3个温度组（p<0.05）。见表2。

20℃低温培养的藻细胞的可溶性蛋白和总糖含量均显著高于其他处理（p<0.05），可溶性蛋白和总糖含量分别为细胞干重的12.2%和4.5%。30、35和38℃培养条件下，藻细胞的可溶性蛋白和总糖含量无显著差异（p>0.05）。

3 讨论与结论

海洋底栖硅藻双眉藻（Amphora ssp.）是鲍鱼、海参和海胆等名贵水产动物苗种生产的优质饵料[17-20]。此外，该藻富含油脂和岩藻黄素，其底栖生长特性可使细胞采收脱水的成本比一般浮游微藻藻类低，因此具有生物燃油或保健品生产开发的潜力。本实验结果表明，温度对海南海域筛选的双眉藻HN08的细胞繁殖速率以及油脂、蛋白和糖等同化物的含量均有显著影响。

生长速率是衡量微藻应用价值的重要指标之一。研究结果表明，在20～38℃温度范围内，双眉藻HN08的比生长速率随温度的升高而增加，38℃静止培养条件下的比生长速率显著高于其他温度条件下的，为0.36 d-1。钱振明[8]等对8种底栖硅藻的研究结果表明，在15～25℃时，8种底栖硅藻的比生长率最大，超过30℃不利于藻类的生长。郭峰等[21]研究表明，分离自海南海区的两种热带底栖硅藻亚历山大菱形藻（Nitzschia alexandrina）和矮小卵形藻（Cocconeis diminuta）的最适温度为30℃；黄海立等[22]测定了简单双眉藻（Amphora exigua）生长的最适温度为28～31℃。周一春等[20]测得从西沙永兴岛附近海域分离的双眉藻（Amphora sp.）的最适生长温度为25～30℃。通过比较可知，本实验藻株是一株较耐高温的底栖硅藻。

微藻将光合作用固定的碳用于合成糖、蛋白和脂肪等物质，参于细胞的生长代谢。许多研究认为，糖和蛋白含量在最适生长温度下达到最大含量[8，23]；但脂肪含量的变化较复杂。一般认为，微藻在不良环境下才会启动脂肪的大量合成和积累[24]。周洪琪等[25]对新月菱形藻和铲状菱形藻的研究表明，总脂含量与温度呈负相关关系。在温度较低时，细胞内的脂肪倾向于以多不饱和脂肪酸的形式存在，以维持细胞膜的流动性；而饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸则随温度升高而增多[26]。

本试验结果表明，温度对热带硅藻双眉藻HN08细胞主要成分的影响与前人的研究结果不同。20℃条件下，双眉藻HN08的比生长速率显著低于其他处理，细胞倍增时间是38℃条件下的近3倍，这表明20℃并非双眉藻的最适生长温度。但在此低温条件下，细胞中的总糖和可溶性蛋白的含量达到了各处理温度条件下的最大值，而总脂的积累量却在30～35℃的适宜生长的温度条件下达到最高值。这可能是与藻种间的代谢差异有关。硅藻的贮藏物质主要是油脂。适温条件下细胞的光合碳同化速率最高，由此增加了光合产物（如糖等有机化合物）的量，最终使得细胞内的贮藏碳基化合物脂的积累量也增加。低温条件下，细胞生长增殖缓慢可能是同化物质积累的主要原因。38℃高温条件最有利于微藻细胞的分裂和生长，但3种同化物质含量都不高，尤其是总脂含量显著低于其他温度处理，可能是高温条件下细胞生长代谢速率加快，从而减少了贮藏物质的含量。

大量研究表明，微藻通常具有在逆境条件下积累油脂的特性，单细胞油脂含量的增加往往伴随着藻细胞生物质产量的下降，从而影响油脂最终产量[27-28]。本研究表明，热带硅藻双眉藻HN08在30～35℃条件下的细胞油脂含量达到最高值，细胞生长繁殖也未受到抑制，可以获得最高的油脂产量，因而具有生产生物燃油的潜力。

温度是影响微藻生命活动的重要因素之一，通过调控温度，可改变微藻细胞生长增殖和细胞代谢产物的积累。由实验结果可知，在生产上，可以首先给予藻细胞生长的最适温度条件，待培养藻细胞达到最高生物质产量后，根据藻种生物学特性改变温度条件，从而获得最高的目的产物产量。

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