拉曼光谱在口腔医学中的应用

2015-08-15 00:50薛丽丽闫冰李一
华西口腔医学杂志 2015年2期
关键词:釉质曼光谱骨组织

薛丽丽 闫冰 李一

1.厦门大学附属第一医院口腔科;2.耳鼻喉头颈外科,厦门 361003;3.口腔疾病研究国家重点实验室 华西口腔医院头颈肿瘤外科(四川大学),成都 610041

随着科学技术的不断发展,特别是交叉学科的兴起和发展,光谱学被越来越多地应用在医学研究中。光谱学主要是通过分析样本的反射光和吸收光之间的改变而研究被测样本的一门学科。在医学研究中,光谱学主要涉及红外光谱、荧光光谱和拉曼光谱[1]。相对于前两者而言,拉曼光谱具有光谱信息丰富,对样本无需特殊处理和受组织内水分影响小等优点,近年来成为临床原位诊断技术的研究热点[2]。本文通过复习文献,对拉曼光谱在口腔医学中的应用作一综述。

1 拉曼光谱的原理

拉曼散射是由印度科学家拉曼于1928年发现[3]。从量子力学的角度解释,拉曼散射是指一部分光射向物体后发生的非弹性散射,其光子的能量被物体分子中处于基态的电子获取使得电子跃迁至一个虚态,处于虚态的电子不稳定,有向外释放能量回到稳态的趋势,向外释放的能量以光子的形态释放出来,释放出这部分光的波长与入射光不同,称作拉曼散射[1,3]。

拉曼图谱是将拉曼散射中散射光和入射光之间的频率改变转化为图谱形式,通常将拉曼散射的强度相对波长的函数图称为拉曼光谱。在拉曼图谱中,蛋白质、脂质、糖类和核酸等生物大分子都有其对应的频移谱带,通过分析这些谱带的变化就可以获取这些生物大分子结构或数量的改变,因此拉曼光谱又被称为“分子指纹”[4]。

随着仪器设备的不断发展,拉曼光谱技术也发展为显微拉曼光谱技术、共聚焦显微拉曼光谱技术、表面增强拉曼光谱技术等。显微拉曼光谱技术是将显微技术与拉曼光谱结合,可以检测如单个细胞等微小样本;共聚焦显微拉曼光谱技术则是结合激光共聚焦原理能够更加精确地检测样本的拉曼信号;表面增强拉曼光谱技术则是借助贵金属表面特有的拉曼增强效应可以指数级地增强拉曼信号强度。随着拉曼光谱技术的发展,从对组织标本的研究到单个细胞的检测[5-6],从对病变组织的检测到临床疾病诊断模型的建立[7-8],从癌症组织检测到体液标本的鉴定[9-10],拉曼光谱技术已被广泛应用于医学研究领域,具有巨大的应用潜力。

2 拉曼光谱在口腔医学不同学科中的应用

2.1 拉曼光谱在口腔内科学中的应用

Guze等[11]利用光导纤维探头获得51个健康志愿者(25个高加索人和26个亚洲人)口腔内不同部位正常黏膜的拉曼光谱。他们使用785 nm、30 mW的近红外激光在不同部位的口腔黏膜处照射1 s,获得正常黏膜的拉曼光谱,结果显示:口腔正常黏膜在1 665 cm-1附近有较强的峰值,其对应的是蛋白质酰胺Ⅰ;而在2 900 cm-1处的峰值则表示是脂质和蛋白质相关分子键的振动。该研究表明不同部位黏膜的拉曼光谱不同,主要跟黏膜的角化程度有关,而与年龄和性别无关。这项研究为拉曼光谱应用于口腔黏膜疾病的临床原位无创诊断打下基础。

Zenone等[12]通过对新鲜的口腔天疱疮黏膜标本和正常黏膜标本的显微拉曼光谱研究发现,相对于正常黏膜,天疱疮病变黏膜在644、1 234、1 423、1 657 cm-1处发生明显改变,可以很好地鉴别天疱疮黏膜组织和正常黏膜组织,具有高度灵敏性。进一步研究[13]发现,天疱疮患者和正常人血浆的拉曼光谱也存在差异;由于血浆获取方便,可以借助拉曼光谱对天疱疮等口腔黏膜疾病进行鉴别诊断[13]。

舍格伦综合征是一种自身免疫性疾病,其特征表现为外分泌腺如泪腺、唾液腺的进行性破坏,导致眼干、口干为主要临床表现的病征。舍格伦综合征的临床诊断主要依据唇腺活检。薛丽丽等[14]通过对正常唇腺及病变唇腺的拉曼光谱进行分析,确定了舍格伦综合征病变唇腺光谱的诊断价值,并通过化学计量学建立诊断模型,可以很好地鉴别病变唇腺及正常唇腺,为拉曼光谱技术在舍格伦综合征病变唇腺的检测提供了可能。

在对牙齿矿化组织进行的拉曼光谱研究中发现,在959 cm-1处有一个强峰值,其位置表示的是磷酸根的振动,此峰值强度从釉质、釉牙本质界到牙本质逐渐减弱,按组织学上无机矿物质从釉质到牙本质逐渐减少来分析,说明其峰值强度与磷酸盐含量有关[15]。Ko等[16]在研究釉质拉曼光谱时发现,釉质光谱具有较强的偏振各向异性,而发生龋坏的釉质的偏振各向异性较弱。正常釉质在959 cm-1有较强的峰值,表示的是磷酸盐的含量较高,而龋坏釉质在959 cm-1峰值较正常釉质弱,提示釉质脱矿导致其磷酸盐含量减少。Ko等[17]通过改进拉曼光谱系统,利用光导纤维收集釉质的拉曼光谱,取得了良好的效果,显示了拉曼光谱诊断早期龋坏的潜力。

在牙周炎诊断方面,拉曼光谱技术也表现出巨大的潜力。Gonchukov等[18]对风干的唾液进行研究时发现,拉曼光谱可以很好地检测出一些唾液中大分子生物标志物,牙周炎患者唾液光谱中波数1 155、1 525、1 033和1 611 cm-1对应的生物标志物与正常对照组唾液有所不同,提示牙周炎患者唾液中类胡萝卜素、糖蛋白、黏蛋白基质等物质发生改变,可作为鉴别诊断依据将牙周炎患者与正常人群区分。

2.2 拉曼光谱在口腔材料学及修复科学中的应用

随着科学技术的发展,越来越多的新型医用材料被应用到口腔科学的临床治疗当中,拉曼光谱为这些材料的研究提供了一种新方法。Gauthier等[19]通过分析拉曼光谱中二甲基丙烯酸单体中C=C双键的强度来检测树脂的固化程度,结果表明:应用拉曼光谱检测树脂固化程度的准确性与传统方法一致,为检测树脂固化程度提供了新的便捷方法。Khalil等[20]和Cassoni等[21]分别应用拉曼光谱对牙科复合树脂的聚合程度进行评价,均获得了满意的效果。复合树脂粘接剂是通过渗透到经酸蚀脱矿的牙本质表面起到粘接作用的,应用拉曼光谱和扫描电子显微镜技术,对比研究一步酸蚀法处理后树脂渗透进牙本质的程度,发现拉曼光谱可以准确地反应树脂渗透的部位,对渗透深度的检测较扫描电子显微镜更加准确[22]。Lopes等[23]在研究激光对种植体周围成骨性的生物调节作用时发现,拉曼光谱可以简单准确地评价种植体周围的成骨量和骨质量,这为种植体周围骨愈合研究提供了一种新技术。

2.3 拉曼光谱在口腔颌面外科学中的应用

口腔癌的发病率和死亡率在头颈部恶性肿瘤中均比较高,能否早期诊断是决定预后的关键[24]。Oliveira等[24]和Malini等[25]通过对口腔黏膜组织切片的拉曼光谱进行研究发现,拉曼光谱能够鉴别正常组织、炎症组织、癌前病变和癌变组织。正常黏膜组织在1 750 cm-1处C=C和1 650 cm-1处C=O键的峰值弱且谱峰尖锐,1 080 cm-1处谱峰宽大,表明磷酸磷脂含量较高;而癌变组织在1 650、1450 cm-1处及1 200~1 350 cm-1处谱峰值强且谱带宽大,这些分别表示酰胺Ⅰ、CH2和酰胺Ⅲ,说明癌变组织中蛋白质含量明显升高。还有学者[26]利用拉曼光谱对活体小鼠口腔上腭黏膜进行研究,结果发现,拉曼光谱对上腭黏膜各种程度的非典型增生及原位癌具有良好的鉴别能力,灵敏度和特异性均在90%以上,特别是对原位癌和重度非典型增生的鉴别灵敏度和特异性均为100%。Li等[27]对口腔黏膜鳞状细胞癌和白斑病变组织的拉曼光谱进行研究,结果发现:与正常黏膜相比,癌变及白斑黏膜拉曼光谱中核酸及蛋白质对应的谱峰明显增强,通过支持向量机建立鉴别诊断模型,诊断准确率达到95%以上。通过拉曼光谱对舌黏膜的原位癌和浸润性鳞状细胞癌的研究也发现了类似现象。在原位癌和浸润性鳞状细胞癌的拉曼光谱中,一些蛋白质的相关谱峰较正常黏膜增强,可以用来作为鉴别正常组织与癌变组织的依据;通过统计分析,可以很好地将正常舌黏膜与癌变组织区分开来,准确率达90%左右[28]。

腮腺肿瘤的术前诊断一直依赖于细针穿刺活检技术,而Yan等[29]的研究为拉曼光谱技术用于腮腺肿瘤的鉴别诊断提供了理论基础。Yan等[29]将腮腺多形性腺瘤、Warthin瘤及腮腺正常组织进行拉曼光谱研究,结果发现:肿瘤组织中核酸和蛋白质相关谱峰较正常组织增高,而正常腮腺中的脂类谱峰明显高于肿瘤组织;以此作为诊断依据,通过支持向量机对光谱数据进行分析,成功鉴别出不同肿瘤及正常腮腺组织,其总体准确率达95%以上。

放射性骨坏死或骨髓炎是头颈部恶性肿瘤经过放射治疗后最严重的并发症之一。临床上如果能早期鉴别出坏死骨组织和正常骨组织,不仅可以早期诊断,同时可以减少骨组织的切除范围,为后期修复手术创造便利条件[1]。McCreadie等[30]对发生过骨折及正常的股骨头组织标本进行拉曼光谱研究发现,发生过骨折的标本的骨组织成分与正常组有明显差异,表明拉曼光谱可以鉴别骨组织内的病理生理改变。Draper等[31]利用可穿透皮肤的拉曼光谱技术对小鼠骨骼进行检测,发现所得到的光谱与直接暴露的骨骼光谱相似。该技术是在普通拉曼光谱仪中加入滤波器,将皮肤和肌肉散射的拉曼光谱过滤掉,而只接收深层组织的拉曼光谱[31-32]。这项技术的应用,使得拉曼光谱应用于临床检测体内深部组织或器官如骨骼组织等成为可能。Lakshmi等[4]在对下颌骨放射性骨坏死的研究中发现,拉曼光谱对骨组织中矿物质和有机物等成分的改变敏感,可以用来评价其有机和无机基质的破坏或改变。该研究将正常骨组织、放射治疗后骨组织和发生放射性骨坏死的骨组织进行研究,拉曼光谱显示:发生放射性骨坏死样本的无机基质结构发生改变,胶原蛋白变性,成骨细胞和破骨细胞减少;将所得的拉曼光谱通过主成分分析法进行计算,3组之间的拉曼光谱存在明显差异,提示拉曼光谱可以很好地鉴别经过放射治疗的骨组织是否发生放射性骨髓炎或骨坏死。

3 结束语

拉曼光谱的优点如下:1)在病变组织尚未发生形态学改变时,拉曼光谱就可检测出样本中因细胞增殖、分化或恶变等引起的生物大分子结构、成分和含量的改变,在肿瘤等疾病的早期诊断中有较高的优势;2)拉曼光谱可以实时、无创、快速对疾病进行诊断和检测,对检测样本无需特殊处理,方便快速,样本可以反复使用,不仅可以检测常规病变组织,还可以检测骨骼和牙齿等高度矿化组织;3)拉曼光谱可以用于分析牙科材料的分子结构和组成,为新材料分析研究提供有力帮助。综上所述,拉曼光谱技术在口腔医学中具有良好的应用前景。

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