阿尔泰瑞香醇化学成分提物及其对癌细胞凋亡的诱导作用

善杜哈喜·巴哈提江，木拉提·克扎衣别克，地达尔·巴合提坚，帕娜尔·沙吾提巴依，热依扎·哈斯木汗，阿依努尔·居马拜

细胞与分子生物学

阿尔泰瑞香醇化学成分提物及其对癌细胞凋亡的诱导作用

善杜哈喜·巴哈提江，木拉提·克扎衣别克△，地达尔·巴合提坚，帕娜尔·沙吾提巴依，热依扎·哈斯木汗，阿依努尔·居马拜

目的检测阿尔泰瑞香可能含有的化学成分，测定阿尔泰瑞香总酚含量，研究阿尔泰瑞香对食管癌Eca-109细胞凋亡的影响。方法采用不同化学定性方法对阿尔泰瑞香中化学成分进行研究；以没食子酸为对照品，采用福林酚比色法测定了总酚含量；以AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡情况。结果阿尔泰瑞香含有黄酮、香豆素、糖、生物碱、酚等化学成分。阿尔泰瑞香乙醇提取物（DA-Et）中总酚含量为159.78 mg/g，测定方法平均回收率为99.4%～108.3%，精密度相对标准偏差为2.04%。DA-Et处理的食管癌细胞凋亡率为（29.633± 1.779）%。结论本研究为阿尔泰瑞香质量标准的提升与合理应用提供了参考，为深入研究阿尔泰瑞香的活性成分提供了依据。

阿尔泰瑞香；化学成分；薄层色谱；总酚；Eca-109细胞；细胞凋亡

阿尔泰瑞香为瑞香科瑞香属植物阿尔泰瑞香（daphne altaica pall）的干燥茎皮，始载于15世纪哈萨克医古典名著Shipagerlik Bayan中。具有发汗解表、止咳祛痰、温中止痛的功效［1］，长期以来在哈萨克传统医学中一直用于癌症和呼吸道疾病的治疗［2］，分布于阿尔泰山脉，即新疆准噶尔盆地以北、哈萨克斯坦东部、俄罗斯的阿尔泰共和国及蒙古的西北部［3］。自20世纪70年代初，人们从瑞香科瑞香属植物中分离出具有抗肿瘤活性的欧亚瑞香素和瑞香毒素后，该属植物便成为一个研究热点。现代研究证实，瑞香属植物具有抗肿瘤、镇痛、抗炎、抗菌、抗血栓、镇静催眠、抗缺氧、抗疟疾、杀虫等作用［4］。如芫花具有抗肿瘤作用［5］；凹叶瑞香具有抗炎作用［6］；白花欧瑞香具有抗菌［7］、抗氧化［8］作用。瑞香属植物化学成分复杂，从中分离出的化合物有香豆素类、双黄酮类、二萜酯类、木脂素内酯类、黄酮类、甾醇类、三萜类、苷类等，其中有明显抗癌活性的有香豆素类（如西瑞香素［9］、瑞香素［10］），双黄酮类（如瑞香黄烷B、瑞香黄烷G-3-甲醚、瑞香黄烷G［11］）、二萜酯类（如从芫花中分离得到的芫花黄素D、芫花黄素H、芫花黄素J［12］等）和丁香树酯醇［13］、瑞香烯酮［14］等。为更好地发挥阿尔泰瑞香在哈萨克医学中的应用，本文对阿尔泰瑞香化学成分进行检测，用福林酚比色法测定总酚含量，并研究其对Eca-109细胞凋亡的影响，以期为阿尔泰瑞香质量标准的提升与合理应用提供参考，为深入研究阿尔泰瑞香的活性成分提供依据。

1　材料与方法

1.1药材与试剂阿尔泰瑞香（2012年7月由阿勒泰地区哈萨克医院提供）。95%乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、瑞香素均购自SIGMA-ALORICH；西瑞香素（芜湖甙尔塔医药科技有限公司），福林酚试剂（国药集团化学试剂有限公司），没食子酸标准品（成都曼斯特生物科技有限公司和中国科学院成都生物研究所）；RPMI1640培养基（GIBCO，美国）、胎牛血清（杭州四季青）、胰蛋白酶（鹏程）、DMSO（Sigma公司）、凯基AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。其余试剂如三氯化铁试液、三氯化铁-铁氰化钾试剂、浓盐酸、镁粉、1%三氯化铝MeOH试液、浓NH4OH试液、改良碘化铋钾试剂、碘-碘化钾试剂、碘化汞钾试剂、20%碳酸钠溶液等均由本实验室自配。

1.2仪器PL4002电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；UV-1750紫外分光光度计，日本津岛公司产品；FD-1-50冷冻干燥机，上海比朗仪器有限公司；倒置荧光显微镜，Lei⁃ca，德国。

1.3乙醇提取与萃取阿尔泰瑞香将500 g的阿尔泰瑞香干燥茎皮粉碎后用体积分数为95%的乙醇于室温下浸提3次，过滤，合并提取液，减压浓缩得浸膏，将浸膏放入低温冰箱内冷冻，用冷冻干燥机干燥24 h，得阿尔泰瑞香乙醇提取物（DA-Et）粉末。粉末用水分散后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，所得萃取液和剩余液分别转移至圆底烧瓶中，于40℃旋转蒸发器减压浓缩成浓浸膏，将浸膏冷冻，以冷冻干燥机干燥24 h，即得阿尔泰瑞香的石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物。

1.4阿尔泰瑞香化学成分预实验首先制备甲醇溶液：取DA-Et粉末5 g，加甲醇100 mL，20℃下超声处理10 min，摇匀；然后进行如下实验测定阿尔泰瑞香化学成分。

1.4.1酚类和鞣质类 （1）三氯化铁实验：取检品的甲醇溶液1 mL，加三氯化铁试液2滴，如呈蓝黑色，证明可能含有酚类化合物。（2）三氯化铁-铁氰化钾实验：取检品的甲醇溶液点在滤纸片上，喷洒三氯化铁-铁氰化钾试剂，如呈蓝色斑点，证明可能含有酚类化合物。

1.4.2黄酮类 （1）盐酸-镁粉实验：取检品的甲醇溶液1 mL，加少量镁粉，然后加浓盐酸4～5滴，置沸水浴中加热2～3 min，如呈桃红色，表明可能有黄酮类化合物存在。（2）三氯化铝实验：取检品的甲醇溶液点于滤纸片上（干后再点1次，使其浓度集中），干后，喷雾1%三氯化铝甲醇试液，在紫外光灯下观察，如呈黄色或黄绿色荧光，表明可能有黄酮类化合物存在。

1.4.3生物碱 （1）取DA-Et粉末0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入浓氨水试液1 mL，静置，浸润1 h，精密加入三氯甲烷∶甲醇（4∶1）的混合溶剂25 mL，加热回流3 h，放冷，过滤，滤液供做以下实验。（2）改良碘化铋钾实验：滤液加改良碘化铋钾试剂，观察有无红色沉淀生成。（3）碘-碘化钾实验：滤液滴加碘-碘化钾，观察有无暗棕色沉淀生成。（4）碘化汞钾实验：滤液加碘化汞钾试剂，观察有无浅黄色沉淀产生。

1.5阿尔泰瑞香中西瑞香素和瑞香素的薄层色谱鉴别制备供试品溶液：精确称取DA-Et粉末75.24 mg，加95%乙醇1 mL，进行超声处理10 min，摇匀即得供试品。对照品溶液：精密称取西瑞香素0.39 mg，瑞香素0.41 mg，各加200 μL甲醇，进行超声处理10 min，即得对照品。吸取供试品溶液和对照品溶液，分别以条带状点于同一氧化铝板（10 cm×10 cm）上，以三氯甲烷∶甲醇∶水（8.5∶0.8∶0.05）为展开剂，预饱和15 min后展开，待溶液前沿距氧化铝板前端1 cm时取出，晾干后，置紫外光灯（波长365 nm）下检视。

1.6阿尔泰瑞香对人食管癌细胞凋亡的作用

1.6.1高糖环境培养的Eca-109细胞复苏、传代、冻存 （1）复苏：从液氮中取出Eca-109细胞株的冻存管，将其转移到底面积为25 cm2的培养瓶中，置于37℃5%CO2的孵箱中培养，次日观察细胞形态。（2）传代：细胞计数后以（2～4）×105个/mL的密度接种到新的25 cm2培养瓶中。置于37℃5% CO2孵箱中培养，每2 d换培养基1次。（3）冻存：选取生长期的细胞，加入冻存培养液（含10%DMSO），冻存液中细胞的最终密度为（5～10）×106个/mL，将细胞梯度冻存，4℃、-20℃、-45℃各梯度放置30～60 min，后转移至-78℃冰箱过夜，24 h后转移至液氮中长期保存。

1.6.2试药精密称取DA-Et粉末，加适量DMSO溶解。待药物完全溶解后，取50 μL，于12 000 r/min离心10 min，取40 μL，加入60 μL的DMSO，使最终浓度为100 g/L。将培养好的食管癌细胞以1×106个/μL接种到培养板中，培养24 h后用新鲜培养基换液，加0.5 μL的DA-Et后培养24 h，共设3个平行组。

1.6.3流式细胞技术检测食管癌细胞凋亡情况收集处理24 h的细胞（培养至80%融合时），用0.25%胰蛋白酶消化，用PBS洗2次（2 000 r/min离心5min）。加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞摇匀；室温，避光反应5～15 min后用流式细胞仪检测，激发波长为488 nm。

1.7阿尔泰瑞香总酚含量测定

1.7.1相关溶液配制 （1）20%碳酸钠溶液：精密量取20 g碳酸钠，置100 mL容量瓶用纯水溶解并稀释至刻度。（2）对照品溶液：精密称取5 mg没食子酸对照品，置50 mL容量瓶用纯水溶解并稀释至刻度。精密量取该溶液15 mL，用纯水定容至50 mL，即得对照品溶液30 mg/L。（3）样品溶液：称取0.05 g DA-Et粉末加入100 mL纯水，40℃加热超声溶解25 min，冷却。分别精密量取7.5 mL样品溶液共5份，用纯水定容至10 mL。

1.7.2检测波长的确定精密吸取没食子酸对照品溶液2.5 mL和供试品溶液1.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加入纯水至5.0 mL，加入0.5 mL福林酚试剂，摇匀6 min后加入20%碳酸钠溶液1.5 mL，用纯水定容至10 mL，室温下避光反应2 h。以试剂溶液为空白，于500～900 nm波长处进行扫描。

1.7.3标准曲线的绘制精密量取上述对照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于10 mL容量瓶中，加入纯水至5 mL，加入0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，摇匀6 min后加入20%碳酸钠溶液1.5 mL，用纯水定容至10 mL，室温下避光反应2 h。以第1个溶液为空白，在745 nm波长处测定对照品溶液的吸光度，以对照品的含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.7.4精密度实验精密量取同一批已知浓度的供试品溶液5份，每份1.0 mL，分别按1.7.3中的方法，以试剂溶液为空白对照，进行含量测定，重复3次。

1.7.5加样回收率实验精密量取同一批已知浓度的供试品溶液10份，每份1.0 mL，分2组，一组各加入没食子酸对照品溶液0.5 mL，另一组各加入1.0 mL，分别按1.7.3项方法下显色，以试剂溶液为空白对照，进行含量测定，重复3次，并计算回收率。

1.7.6DA-Et中总酚含量测定及重现性实验取5份DAEt，每份约3.75 mg，加入10 mL纯水于40℃加热超声溶解25 min，冷却。各取供试品溶液1.0 mL，分别按1.7.3中的方法测定并计算总酚含量（mg/g）=C/10 m；C为10 mL供试品溶液中总酚浓度（g/L），m为供试品取样量（g）。

2　结果

2.1阿尔泰瑞香化学成分初步分析结果DA-Et中可能含有黄酮、生物碱、酚类化合物，见表1。

Tab.1　Chemical constituent of Daphne altaica pall表1　阿尔泰瑞香化学成分

2.2薄层色谱实验结果供试品与对照品在同一薄层板相应的位置上，显相同的斑点，见图1。

Fig.1　TLC of UV chromatogram图1　365 nm紫外光下（A）和日光下（B）的色谱图

2.3流式细胞检测食管癌细胞凋亡结果Annexin V-FITC/PI双参数图上可见经DA-Et处理后的Eca-109细胞在Annexin V-FITC+、PI-象限中的分布显著，见图2。DA-Et处理后的细胞凋亡率为（29.633±1.779）%。

Fig.2　The apoptosis rate of esophageal cancer cell line after treatment of DA-Et图2　DA-Et处理后的食管癌细胞凋亡检测图

2.4总酚含量的测定结果没食子酸对照品溶液在745 nm波长处有最大吸收，供试品溶液在此波长也有最大吸收，故检测波长为745 nm，见图3。

Fig.3　Absorbtion spectrogram of sample and standard solution图3　样品与没食子酸对照品的吸收光谱图比较

2.4.2精密度实验结果显示该方法精密度相对标准差为2.04%，说明此方法稳定性良好。

2.4.3加样回收率实验结果加样回收率为99.4%～108.3%，表明此方法测定结果准确度较高，见表3。

Tab.3　Recovery rate of sample solution表3　供试品溶液的加样回收率

2.4.4DA-Et总酚含量测定及重现性实验DA-Et中总酚含量为（159.78±1.90）mg/g，相对标准差为1.19%，表明具有很好的重现性。

3　讨论

阿尔泰瑞香作为哈萨克民间常用药之一，在治疗风寒感冒、气管炎、咳嗽、胃痛不适、关节炎、咽痛、牙痛、食管癌、胃癌方面有着很独特的疗效。虽然阿尔泰瑞香在哈萨克传统医学中已用于食管癌等恶性肿瘤的治疗，国内外也有有关黄瑞香、唐古特瑞香等瑞香属植物的研究报道，但其抗肿瘤有效部位及有效成分不明确，尚未见有关阿尔泰瑞香化学成分及药理作用的文献报道和相关发明专利。

本实验通过薄层色谱鉴别及化学成分系统预实验，初步检定了阿尔泰瑞香可能含有黄酮、香豆素、糖、生物碱、酚类化合物等成分，以没食子酸为对照品，采用福林酚比色法测定阿尔泰瑞香中的总酚含量，此方法具有操作简便快捷，设备要求低，稳定性和重现性好等优点，是检测阿尔泰瑞香总酚的可靠方法。用Annexin-V单阳性细胞为凋亡细胞，An⁃nexin-V与PI双阳性为坏死细胞，双阴性细胞为活细胞分析DA-Et处理24 h的食管癌细胞的凋亡，从实验结果中可以看到DA-Et具有明显的诱导凋亡作用。对阿尔泰瑞香的抗癌物质基础和作用机制进行研究具有较大实际意义和较高的学术价值。本研究丰富了阿尔泰瑞香化学成分的研究资料，为今后深入研究哈萨克药资源的调查，提升阿尔泰瑞香质量标准，研究阿尔泰瑞香抗癌机制提供了可借鉴的科学依据。

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（2014-07-15收稿2014-09-10修回）

（本文编辑闫娟）

Chemical constituents of ethanol extracts from Daphne altaica pall and their pro-apoptotic role in cancer cell

BAHYTJAN Sandugash，KIZAIBEK Murat△，BAHYTJAN Didar，SAWYTBAI Panar，KASYMKAN Ryza，JUMABAI Ainur
Traditional Kazakh Medicine Research Institute of Ili Kazakh Autonomous Prefecture，TCM Hospital of Ili Kazakh Autonomous Prefecture，Yili 835000，China
△Corresponding Author E-mail：murat_kizaibek@sina.com

ObjectiveTo investigate the chemical constituents of the ethanol extract of Daphne altaica Pall（DA-Et），to determine total phenolic content in DA-Et and to study the effect of DA-Et on cell apoptosis in Eca-109 cells.Meth⁃odsDifferent chemical assays were performed to detect chemical constituents of DA-Et.The content of total phenolics，ex⁃pressed as gallic acid equivalents，was measured by Folin-Ciocalteu assay；Cell apoptosis induced by DA-Et was detected by AnnexinV-FITC/PI flow cytometry.ResultsFlavonoids，coumarins，sugars，alkaloids and phenolics in DA-Et.The contents of total phenolics in DA-Et was quantified as 159.78 mg/g.Average recovery rate of this method ranged from 99.4%to 108.3%and the precision relative standard deviation was 2.04%.Apoptosis rate of Esophageal cancer cell line Eca-109 induced by DA-Et was detected as 29.633%±1.779%（n=3）.ConclusionOur study provide guidance for the im⁃provement of DA-Et quality，its appropriate application and further research of its activity.

Daphne altaica Pall.；chemical constituents；TLC；total phenolics；Eca-109 cells；cell apoptosis

R282，R735.1

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.004

国家自然科学基金资助项目（81360499）；新疆地产中药民族新药研发项目（XJHPHY-2010-YH）；自治区科研机构创新发展专项资金（2013002）；伊犁哈萨克自治州科技计划项目（YZ201201034）

伊犁哈萨克自治州哈萨克医药研究所、伊犁哈萨克自治州中医医院（邮编835000）

善杜哈喜·巴哈提江（1990），女，学士学位，主要从事哈萨克药研究

△E-mail：murat_kizaibek@sina.com