突变型P53蛋白在肺腺癌中的表达及其临床意义

卞春安 李忠佑 许有涛 王洁 许林 沈洪兵

TP53基因作为一种非常经典和重要的抑癌基因，一直以来受到广泛的关注和研究[1]。其编码的P53蛋白是一种应激反应蛋白，可以通过调节基因转录来应对基因毒性应激、癌基因信号激活以及DNA损伤等不利因素。近来的全基因组关联研究（genome wide association study, GWAS）提示TP53基因是人类恶性肿瘤中突变频率最高的基因之一[2]。相对于其他抑癌基因突变后仅仅是丧失了抑癌功能，TP53基因突变有其独特的特性，即突变的基因获得了新的促癌功能（gain of function, GOF）[3]。目前已有许多有关TP53突变在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中作用的研究，但结论尚不一，而且单独对TP53突变在肺腺癌中作用的研究则更为少见[4-7]。虽然同为NSCLC，肺鳞癌和肺腺癌的基因突变谱是完全不同的，研究[8-10]发现TP53、EGFR、KARS、ALK、PIK3CA、SMAD4等基因是肺腺癌的常见的驱动基因，因此将肺鳞癌和肺腺癌分别研究更为合理。由于突变的TP53基因编码的P53蛋白半衰期较长，而野生型TP53基因编码的P53蛋白半衰期极短，所以突变型P53蛋白在细胞核内积累从而可以被免疫组化法检测，而野生型P53蛋白无法被免疫组化法检测到[11]。本研究利用免疫组化SP法检测突变型P53蛋白在肺腺癌组织中的表达情况，分析其与患者临床病理特征及预后的关系，探讨突变型P53蛋白在肺腺癌中的作用及其对预后的影响。

1 资料与方法

1.1 标本及病例资料来源 收集南京医科大学附属江苏省肿瘤医院2007年1月-2009年3月期间手术切除并经术后病理确诊为肺腺癌的石蜡标本120例。所有纳入研究的患者均有完整的病历及随访资料。随访期间死于其他疾病的患者不被纳入研究。所有患者接受的均为根治性手术，所有患者术前均未接受放疗或化疗。本研究经江苏省肿瘤医院医学伦理委员会批准。

1.2 免疫组化SP法测定突变型P53蛋白表达 鼠抗人突变型P53单克隆抗体购自Santa Cruz公司（克隆号clone SC126），SP试剂盒购自北京中山公司。染色方法采用常规SP法，突变型P53一抗工作浓度为抗体原液稀释1,000倍。采用生物素标记的二抗进行染色。用已知的阳性胰腺癌组织作为阳性对照，使用PBS缓冲液代替一抗做为阴性对照。

1.3 免疫组化结果判定 突变型P53蛋白的表达主要定位于细胞核，以胞核中有棕褐色颗粒染色为阳性（图1）， 每个切片于高倍镜下随意取5个不重复视野计数，计数所有细胞，表达强度按阳性细胞所占百分比进行判断，取其平均值，以阳性细胞数≤10%为阴性，阳性细胞数＞10%为阳性。免疫组化的结果判定由两个高年资病理科医生共同作出。

1.4 统计学方法 实验数据应用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，组间率的比较采用χ2检验，单因素生存分析采用Kaplan-Meier法（Log-rank检验），多因素生存分析采用Cox风险比例模型。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床病理特征及预后 所有纳入研究的患者中男性58例，女性62例。手术时的平均年龄为59.4岁。截止到随访时间（2014年3月）有20.8%（25例）的患者仍存活。采用寿命表法统计出患者的1年、3年、5年的生存率分别为61%、39%、33%。肿瘤大小≤3 cm（T1）的占20%（24例），＞3 cm≤7 cm（T2）的占60.8%（73例），＞7 cm（T3、T4）的占19.2%（23例）。淋巴结转移的占40.8%（49例）。肿瘤高分化的占26.7%（32例）、中分化的占34.1%（41例）、低分化的占39.2%（47例）。仅有10.8%（13例）患者有胸膜侵犯。临床分期为I期、II期和III期的患者分别占30.8%（37例）、39.2%（47例）和30.0%（36例）（表1）。

2.2 突变型P53蛋白的表达及其与临床病理特征的关系 免疫组化法检测突变型P53蛋白在肺腺癌组织中的表达率为63.3%（76/120）。卡方检验显示突变型P53蛋白的表达与患者肿瘤大小（P=0.041）和临床病理分期（P=0.025）有相关（图1）。

2.3 突变型P53蛋白的表达及临床病理特征与预后的关系运用Kaplan-Meier法对120例患者进行单因素生存分析发现，肿瘤的大小（P=0.031）、淋巴结转移（P＜0.001）、临床病理分期（P＜0.001）、突变型P53蛋白的表达（P=0.038）与患者的总生存期密切相关（图2）。对单因素分析中P＜0.05的因素进一步进行Cox风险比例模型多因素，结果显示仅有淋巴结转移（P=0.014）为肺腺癌总体生存期的独立预后因素（表2）。

表1 突变型P53的表达患者临床病理参数的关系Tab1 Mutant P53 expression in relation to clinicopathological parameters (n=120)

3 讨论

肺癌是当今世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一[12]，并且流行病学统计发现肺癌中的肺腺癌发病率越来越高，目前已经取代肺鳞癌成为发病率最高的NSCLC[13]。长期以来，以肺鳞癌和肺腺癌为代表的NSCLC的预后无明显改善，直到近十年来，随着分子生物学的进展，EGFR、KARS、TP53等一批肺腺癌驱动基因被陆续发现[14]，导致一些靶向治疗药物的出现，极大地改善了肺腺癌患者的预后[15,16]。人类TP53基因定位于17号染色体p13，全长16 kb-20 kb，含有11个外显子，转录2.8 kb的mRNA，编码蛋白质为P53，是一种核内磷酸化蛋白。TP53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因。过去一直把它当成一种癌基因，直至1989年才发现起癌基因作用的是突变的P53，后来证实野生型P53是一种抑癌基因，在正常情况下，细胞中野生型P53蛋白的含量很低，且半衰期极短，所以很难检测出来。一直以来，TP53基因都是生物学界研究的热点，有关野生型的TP53基因的抑癌作用和突变型的TP53的致癌功能，已经得到公认。众多临床证据[17]也显示TP53基因突变与多种恶性肿瘤的不良预后有关。尽管如此，突变的TP53在肺癌中的意义尚不明确。Ding等[18]发现45%的肺腺癌患者的TP53基因存在突变，而本研究中肺腺癌组织中测得的TP53突变率为63.3%，较其报道的突变率略高。Ahn等[11]报道TP53的突变与NSCLC的预后无关。而另一些报道[19-22]则认为TP53突变是NSCLC的不良预后标志。本研究中亦发现TP53的突变与患者不良的总生存期预后有关，但并不是独立预后因素，猜测可能是因TP53基因是一个关键基因，调控多种基因的转录表达、作用及机制较为多样复杂所致。另外，有报道[23,24]在动物实验中发现含有TP53突变的小鼠肿瘤更具侵袭性更容易转移。但本研究中未发现TP53突变与肿瘤转移相关，仅与肿瘤的大小及临床病理分期相关。对于肺癌中TP53突变的作用各个研究得出的结论不一，我们认为可能与分子的异质性、TP53突变的各种不同基因型以及实验采用的不同方法、不同分组、样本量的大小不同有关。故今后需要进行更大样本量的实验，更加完善的实验方法，以取得较为可靠一致的结论。

表2 患者总生存期的单因素及多因素分析Tab2 Univariate and multivariate analyses of overall survival (n=120)

图1 突变型P53在肺腺癌组织中的免疫组化（SP法，×100）。A：突变型P53阳性表达（细胞核棕黄色染色）；B：突变型P53阴性表达。Fig1 Mutant P53 expression in lung adenocarcinoma by immunochemistry (SP, ×100). A: Positive mutant P53 expression (staining was detected in nucleus); B: Negative mutant P53 expression.

综上所述，本研究应用免疫组化法对120例肺腺癌患者的突变型P53蛋白进行了检测，发现其与患者的肿瘤大小，临床病理分期及总生存期有关。本研究结果提示TP53突变是肺腺癌患者不良预后的一个重要因素，未来值得对相关机制进一步进行研究。

图2 突变型P53蛋白表达与总生存期的生存曲线Fig2 The overall survival curve of patients according to mutant P53 expression