基因工程酵母菌株Kanr基因敲除

原韬，夏海华，于冲，沙长青，2（.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨5000；2.黑龙江省科学院，哈尔滨5000；3.哈尔滨工业大学，哈尔滨5000）

基因工程酵母菌株Kanr基因敲除

原韬1，3，夏海华1，于冲1，沙长青1，2
（1.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150010；2.黑龙江省科学院，哈尔滨150001；3.哈尔滨工业大学，哈尔滨150001）

前期构建的发酵菌株酿酒酵母（Saccharom yces cerevisiae）SC18-2377在引入外源功能基因的同时引入了抗性基因kanr，抗性基因的存在对工程菌株后续应用和产品生物稳定性、安全性都有较大的影响。本研究在该菌株的基础上，利用基因工程方法将外源抗性基因kanr成功敲除，获得了一株带有外源目的基因，无外源抗性基因的基因工程酿酒酵母菌株。

酿酒酵母；抗性基因；敲除

木质纤维原料是地球上最丰富廉价的非粮可再生资源，全世界每年通过光合作用产生的木质纤维生物中超过90%的资源尚未被人类所利用［1］。传统酿酒酵母能够利用葡萄糖、甘露糖和半乳糖，但无法利用木糖［2］，国内外研究在利用赋予酿酒酵母木糖代谢能力上进行了广泛的研究［3-5］。本课题组在前期构建的基因工程菌株的时候出于筛选目的引入了外源抗性基因。外源基因的存在直接影响工程菌株发酵生产的用途，对后期在医学、食品、环境等方面进一步应用带来了不便。本研究在前期工作的基础上，利用基因工程方法将外源抗性基因成功敲除，获得了一株带有外源目的基因，无外源抗性基因的酿酒酵母菌株。

1　材料与方法

1.1供试菌种和质粒

酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）SC18-2377株为黑龙江省科学院微生物研究所前期构建菌株；质粒pSH 65由中国科学院青岛生物能源与过程研究所提供。

1.2PCR扩增引物

Kan（F），Kan（R）xylA（F）及xylA（R），用于鉴定Kanr基因敲除结果和外源xylA基因存在，合成引物序列信息详见表1。

表1　引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3工具酶及试剂

Taq plus酶购自天根生化科技有限公司；限制性内切酶、RNA酶（DNase free）购自宝生物工程有限公司，Plasm id M iniKit购自上海华舜生物科技有限公司；Gel Extraction M iniKit购自上海华舜生物科技有限公司。

1.4培养基

LB液体、固体培养基；YEPD液体、固体培养基。

2　实验方法

2.1酿酒酵母预处理

取酿酒酵母SC18-2377斜面菌种，于YEPD平板上进行三区划线，30℃培养直至长出单菌落。挑取单菌落接种于10m L/50m L YEPD液体培养基中，30℃140r/m in振荡培养过夜。测定菌液的在OD600nm下的吸光值，使其稀释至50m L时吸光值达到0.4，继续培养2～4h至吸光值达到0.8～1.0。

2.2pSH 65质粒转化

将OD600nm下的吸光值达到0.8～1.0的SC18菌液在无菌条件下4 500r/m in室温离心10m in弃上清；加入40m L 1×TE溶液悬浮洗涤沉淀，4 500r/m in室温离心10m in弃上清；加入2m L 1×LiAc/0.5×TE溶液，悬浮沉淀后，室温放置10m in。

另取一无菌离心管，分别加入100μL经过上述处理的酵母菌悬液，1μg纯化后的pSH 65质粒DNA，100μg变性鲑精DNA，700μL1×LiAc/40% PEG-4000/1×TE混合均匀。以未加质粒DNA的体系作为阴性对照。30℃反应30m in后，加入88μL DMSO原液，混合均匀，40℃水浴7m in，13 000r/m in室温离心10s，弃上清，1×TE洗涤沉淀2次，加入50～100μL 1×TE和500μL YEPD液体培养基，30℃、150r/m in复苏6h。取200μL涂布于YEPD固体平板上，30℃培养2～4d，待菌落生长。

2.3酿酒酵母重组子的筛选与鉴定

挑取平板上长出的菌落，在不含任何抗性的YEPD斜面上传10世代，确定菌株的遗传稳定性。以构建菌株培养菌液为模板，分别以xylA（F）及xylA（R），Kan（F）及Kan（R）为引物，验证酿酒酵母SC18-2377重组子染色体上是否具有构建的外源基因xylA和基因kanr。

3　结果与讨论

3.1敲除后鉴定结果

图1　kanr基因PCR扩增检验结果：1 DNA Marker D2000；2敲除Kanr基因后PCR扩增结果；3初始菌株对照PCR结果Fig.1 kanrgene PCR amplification result:1 DNAMarker D2000；2 Strain kanrgene knocked out；3 Initia lcontrolstrain PCR am plification result

挑取敲除后的菌株在不含有抗生素的斜面传代培养后，接种于YEPD液体培养基中摇床培养。以菌液为模板，分别以xylA（F）及xylA（R），Kan（F）及Kan（R）为引物，对kanr基因和xylA基因进行融合PCR扩增检验，敲除后菌株未获得kanr阳性扩增，xylA基因有阳性扩增，见图1、2。

图2　敲除后菌株PCR扩增xylA结果：M DNAMarker D2000；1-3：敲除后菌株PCR扩增xylA基因结果Fig.2 Knockoutstrain xylA gene PCR am plification result:1 DNA Marker D2000；1-3 Knockout Strain xylA gene PCR am plification result

3.2结语

利用多种原料水解产物发酵生产乙醇是目前世界范围的研究热点，在利用不同方法使初始菌株增加或减少外源基因的过程中出于筛选菌株的目的，往往会引入外源抗性基因，抗性基因的存在会为下游工作带来多种不利影响，因此，如何有效地将外源抗性基因从工程菌株中去除就成为了一个构建工程菌株的关键环节，各国科学家在该领域做出了多种尝试，但目前各种方法普遍存在步骤烦琐、消除效果差、回复突变率高的不足，在今后的研究中如何能够有效克服这些不足仍是科研工作者面临的巨大挑战。

［1］钟桂芳，傅秀辉，孙君桂，等.发酵木糖生产酒精的研究进展及其应用前景［J］.微生物学杂志，2004，24（1）：42-45.

［2］BARNETT JA.The utilization of sugars by yeasts［J］.Adv Car-bohydr Chem Biochem，1976，（32）：125-234.

［3］TOIVARIMH，ARISTIDOU A，RUOHONEN L，PENTTILA M.Con-version of xylose to ethanol by recombinant Saccharomyces cerevisiae:importance of xylulokinase（XKS1）and oxygenavailability［J］.Metab Eng，2001，（03）：236-249.

［4］SEDLAK M，HO NW.Production of ethanol from cellulosic biomasshydrolysates using genetically engineered Saccharomy-ces yeast capab le of cofermenting glucose and xylose［J］.Appl Biochem Biotechnol，2004，（113-116）：403-416.

［5］SEDLAK M，HONW.Characterization of the effectivenessof hexose transporters for transporting xylose during glucose and xylose co-fermentation by a recombinantSaccharomyces yeast［J］.Yeast，2004，（21）：671-684.

Genetically KanrKnockout in Engineered Yeast Strain

YUAN Tao1，3，XIAHai-huan1，YUCong1，SHAChang-qing1，2
（1.InstituteofMicrobiology，HeilongjiangAcademy of Sciences，Harbin150010，China 2.Heilongjiang Academy ofSciences，Harbin 150001，China 3.Harbin InstituteofTechnology，Harbin 150090，China）

Pre-built fermentation strain Saccharomyces cerevisiae SC18-2377 was introduced exogenous functional genemeanwhile resistance genes kanrwas added to the strains as a selectmarker.The presence of resistance genes in strains hasmore negative impact on engineered strains product's stability and security.In this study，genetic engineeringmethodsw ere used to knockoutexogenous kanr.Strainswith exogenous functionalgene noexternal resistanceexogenouswasobtained.

Saccharomyces cerevisiae；Resistancegenes；Knockout

Q78

A

1674-8646（2015）05-0004-02

2015-03-27

黑龙江省科学院科学研究基金项目资助（KY13BYTV10）

原韬（1979-），男，黑龙江哈尔滨人，助理研究员，在读博士，从事微生物学研究。

沙长青（1965-），男，研究员，博士研究生导师，从事农业微生物研究，e-mail：shachangqing@163.com