寒区湖库型水源供水系统中耐氯菌的生长

祝泽兵，吴晨光，钟 丹，袁一星，单莉莉，袁 媛，魏星际，张 杰

(1.城市水资源与水环境国家重点实验室(哈尔滨工业大学)，150090哈尔滨;2.哈尔滨工业大学市政环境工程学院，150090哈尔滨;3.华东交通大学土木建筑学院，330013南昌;4.哈尔滨供水工程有限责任公司，150060哈尔滨)

由于氯的消毒效率高、稳定性好、易于使用、成本低廉等优势，仍然是使用最广泛的消毒剂［1］.研究发现在保持一定余氯浓度的条件下，仍然有细菌能够存活，甚至有一部分细菌能够在含有较高余氯浓度的自来水厂、管网等供水系统中生存.这些对氯具有较高耐受性的细菌被称作“耐氯菌”(chlorineresistant bacteria，也译为“抗氯菌”)［2-4］.然而，由于消毒效率跟测试的条件、方法密切相关，在科学的范畴上，耐氯菌的耐受性只是一个相对的概念，并不是一个准确的术语［5-6］.

加氯消毒的过程本身就是对耐氯菌选择的过程［5］，也会使耐氯菌成为优势菌［7］.这些存在于供水系统中的耐氯菌会对饮用水的安全性造成巨大危害.一方面有些耐氯菌本身就是病原菌或者条件致病菌，如分枝杆菌(Mycobacteriumspp.)、军团菌(Legionellaspp.)、铜绿色假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等［8-10］;另一方面，由耐氯菌导致氯消毒的失效，并由此引发供水管网中的细菌再生长，进一步增加了细菌的耐氯性，使得供水管网中的细菌状况进一步加剧，进而引起用户龙头水细菌总数、色度、浊度等水质指标超标［11-13］.由于耐氯菌处于一个贫营养条件下并维持较高浓度余氯的极端环境体系下，大大限制了对供水管网中耐氯菌的研究.为此，对东北某市寒区湖库型水源净水厂加氯前后和供水管网中不同水龄、管道材质、管龄的主体水和生物膜中耐氯菌的变化规律进行研究，以期为供水微生物安全的评估、预防和控制提供理论基础.

1 实 验

1.1 寒区湖库型水源供水系统描述

该供水系统由典型的寒区湖库型水源净水厂供水［14］，原水浊度为 0.34～14 NTU，pH 6.10～7.49，碱度(CaCO3)8～48 mg/L，氨氮为 0.04～0.20 mg/L.检测数据均值中除大肠菌群为Ⅱ～Ⅲ类外，其他项目均满足Ⅱ类水质.净水厂建于2006—2009年，常规处理工艺为机械混合+水平轴机械絮凝+斜管沉淀+双层滤料翻板滤池过滤+液氯消毒，设计总供水能力90×104m3/d，目前实际最高日供水量约为 79×104m3/d，平均日供水量 67×104m3/d.

根据该市的区域供水管网特征和水质特点，选取具有代表性的供水管网开展对比分析，该供水系统取样点基础信息见表1.

表1 供水系统取样点基础信息

1.2 分析测定方法

在该市某净水厂清水池和供水系统(二次供水水箱)清洗期间(一般1年清洗1次，清洗时间为4月末—6月初或9—10月)，于净水厂滤池生物膜直接采集滤池反冲洗前期废水颗粒(干样约为10 g)，采集清水池出水端下部高0.5 m处面积约50 cm×50 cm的池壁生物膜，水厂食堂连接水龙头PPR管面积约100 cm2的管内壁生物膜，二次供水水箱进水端下部高0.15 m处面积约30 cm×30 cm池壁生物膜.在清洗前，开展供水系统的主体水水质测定，为期1 a，每月采集水样一次，包括水厂滤后水、清水池出水、食堂龙头水和各二次供水水箱市政进水5 L.所采得的生物膜和主体水水样及时运回实验室，并保存于4℃冰箱，在8 h内进行相关项目的分析.其中耐氯性细菌检测的水样与生物膜在同一时期内采集.

1.2.1 生物膜和进出水异养菌平板计数(HPC)测定

将待计数的生物膜悬浮液置于超声波振荡器中冰浴超声振荡1 min，间歇1 min，如此重复3次，然后再漩涡振荡30 s，使生物膜中的细菌能够均匀分布在悬浮液中，之后将悬浮液稀释适宜质量浓度在R2A固体培养基上进行异养菌总数平板计数(HPC-R2A)［15］.R2A固体培养基主要成分:酵母0.5 g，酪蛋白酸水解物 0.5 g，可溶性淀粉 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，胰蛋白胨 0.25 g，蛋白胨 0.25 g，葡萄糖 0.5 g，丙酮酸钠0.3 g，K2HPO40.3 g，琼脂 15 g，蒸馏水 1 L;并用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠调节 pH 为7.2～7.4.主体水、滤后水和供水末端水样直接倍比稀释，涂布于R2A固体培养基上;清水池和供水前端水样用0.22μm滤膜过滤10～100 mL的水样，然后将滤膜截滤微生物的一面向上贴于R2A固体培养基上进行HPC计数.将处理好的R2A培养基平板放于20℃倒置恒温培养10 d，即可获得异养菌平板计数.

1.2.2 耐氯性细菌检测

耐氯性细菌检测参考陆品品［16］和 Mathieu等［17］的方法，并做适当修改.对于生物膜样品，在加氯前，引入超声波和漩涡振荡法分散细胞群体生物膜，使生物膜中的个体细胞释放出来，尽量减少消毒剂在生物膜基质中扩散限制和反应抑制作用［4，18］，使得氯能渗透到更多细菌个体细胞表面，耐氯的细菌得以检出.检测方法如图1所示，将混匀的生物膜悬浮液(经1.2.1方法处理)和主体水样品，置于经过灭菌处理的取样瓶(1 L棕色细口瓶，密封).其中1份样品保持一定质量浓度的Cl2消毒剂(根据出厂水的平均余氯质量浓度，加入NaClO溶液使pH调至近中性.由于生物膜悬浮液会消耗更多的余氯，在生物膜悬浮液中比主体水中多加20%～50%的余氯溶液［19］，混匀，待余氯稳定后再测余氯质量浓度，使主体水和生物膜悬浮液的余氯终质量浓度均保持在0.60 mg/L)，常温过夜静置12 h(根据该市的区域供水管网特征和水质特点，选取处于该市供水管网中间位置的H5采样点的水力停留时间，具有代表性);另1份样品加入Na2S2O3，中止消毒，冷藏保存.12 h后，依据1.2.1的检测方法取样测定这2瓶水样中的HPC-R2A值，重复3次以中止消毒样品中HPC-R2A值作为管网出水细菌本底值，另一份样品为维持消毒剂作用12 h后HPC-R2A值，作为管网出水可能的耐氯菌检测值.

图1 耐氯性细菌检测方法示意

1.2.3 主体水其他水质测定方法

1.2.4 扫描电镜观察

采用扫描电镜观察上述生物膜的形态，扫描电镜样品前处理方法:样品在2.5%的戊二酸溶液中4 ℃固定过夜;倒掉固定液，用 0.1 mol/L、pH 7.0 的磷酸盐缓冲液漂洗样品3次，每次15 min;冷冻干燥;样品黏附在样品台上，喷金，在Quanta 200环境扫描电子显微镜(美国FEI公司)上观察.

1.3 数据处理方法

耐氯性细菌检测时加入 0.60 mg/L的 Cl2，经12 h的灭活率为D=log10(N0/Nc)，其中N0为不加氯12 h后的 HPC-R2A值，Nc为加氯 12 h后的HPC-R2A值.运用 SPSS 13.0统计分析软件对常规指标和细菌总数等进行方差分析和相关性分析.

2 结果与讨论

2.1 供水系统主体水细菌再生长

表2为供水系统不同取样点主体水水质，可以看出，该供水系统的出厂水(清水池水样)均优于《生活饮用水卫生标准 GB 5749—2006》规定的相应水质指标，出水水质较好.如表1，2所示，本研究所选择的供水系统在一个完整的监测周期内，细菌再生长现象随着供水管线的延长有增大的趋势，但相关不显著.供水管网中细菌数目与管材、管龄相关度不明显，在新管网(管龄1～4 a)中细菌再生长现象仍然很普遍，很严重.供水管网中细菌数目与消毒剂质量浓度呈一定的负相关(r=-0.51，p=0.04)，由于消毒剂的存在细菌再生长现象在管网中受到一定程度的抑制，但这种抑制很有限，在余氯质量浓度大于0.2 mg/L时仍然存在大量的细菌.Zhang等［21］在美国北卡罗莱纳州Durham县的两座加氯供水系统也发现了细菌再生长现象，并且认为消毒剂质量浓度是决定HPC水平的最重要因子，管网中的细菌再生长是管网中水质化学、物理及运行参数等复杂交互作用的结果，而不是简单的统计学关系.因此，需要重点开展供水管网主体水和生物膜细菌再生长及耐氯性细菌的研究.

表2 供水系统不同取样点主体水水质

2.2 供水系统主体水和生物膜中耐氯性细菌

2.2.1 主体水中耐氯性细菌的存在性分析

如图2所示，所选取的6个取样点中，主体水中总细菌和耐氯细菌的存在差别很大.该供水系统中异养菌总数在50～22 000 CFU/mL，滤后水在清水池消毒后达近3-log灭活率，加氯消毒去除了大部分微生物.在不同水样中继续加入0.6 mg/L的Cl2，发现各采样点仍存在一定数目的细菌(130～830 CFU/mL)，可以认为这部分细菌具有较高的抗氯性，为耐氯菌［3，6］.滤后水中的耐氯菌数目最多(830 CFU/mL)，显著大于其他加氯后主体水的耐氯菌数目(P＞0.01).在出厂水 0.6 mg/L 余氯水平下，自来水经管网输送，耐氯菌的数量随着管线的延长逐渐增加，但差异无统计学意义(P＞0.05)，其中存在的耐氯菌在管网中一般小于350 CFU/mL，各管网采样点的耐氯性检测的氯灭活率均不到35%.研究表明，在出厂水水质较好的管网中，管网生物膜是主体水微生物的的主要来源［22］，因此，可以推测该部分细菌可能主要来源于管壁生物膜的脱落，而脱落的管壁生物膜的微生物在氯的存在下仍然可以再生长［21，23〛，这些脱落的管壁生物膜中的微生物势必会对饮用水安全性造成危害.生物膜的存在对部分细菌起到了保护作用，使其免于消毒剂的灭活，从而在高质量浓度余氯的供水管网中存活［1，4］，而且悬浮颗粒上的细菌与悬浮菌相比抗氯性至少增加44%［24］.因此，管壁生物膜的冲刷脱落是该供水管网出水细菌耐氯的重要来源之一.

图2 供水系统主体水中总细菌和耐氯细菌数目

2.2.2 生物膜中耐氯性细菌的存在性分析

图3是该供水系统生物膜中总细菌和耐氯细菌的分布.在水厂反冲洗废水颗粒中存在109CFU/g的细菌，经耐氯菌检测后还存在104CFU/g，显著大于其他加氯后的生物膜耐氯菌数目(P＜0.05).在清水池壁上的总细菌和耐氯菌数目只有103CFU/cm2，这说明经水厂过滤后截留了大量的细菌，而耐氯菌相对不容易被截留.研究表明，在经过滤处理的加氯(约为0.5 mg/L Cl2)自来水中发现了大量的极微细菌(＜0.20μm)［25］.经消毒输送至管网后，管网生物膜的总细菌数超过106CFU/cm2，耐氯菌数目也维持在103CFU/cm2水平.结果表明，随着管网延伸，管网生物膜的耐氯细菌数目也呈增长趋势.随着消毒剂质量浓度的下降，管网生物膜中的细菌数目也在逐步上升，其中耐氯细菌也会进一步增加.

图3 供水系统生物膜总细菌和耐氯细菌数目

2.2.3 主体水和生物膜中耐氯性细菌的对比

图4为该供水系统主体水和生物膜悬浮液中细菌灭活率的对比.与主体水相比，生物膜悬浮液中的细菌灭活率均较大.一般认为细菌的抗氯机制可以分为细菌的个体原因和群体原因［18］，即可以分为浮游生物的抗氯性和细菌群体生物膜的抗氯性，实际供水系统中细菌群体生物膜抗氯性占大多数［4，18］.由于消毒剂在细菌群体生物膜基质中的扩散限制和反应抑制，消毒剂不能深入生物膜底层;同时，细菌长期在亚致死质量浓度的消毒剂中生长也会导致部分个体细菌的抗氯性增加［4，18］.在生物膜中细菌对消毒剂的抗性，很多时候并不是该细菌的真正抗性，当生物膜基质的保护作用得以消除，这部分细菌将会被消毒剂杀死［1，4］.而本研究主要检测的是个体细菌的耐氯性，因此，生物膜悬浮液中的大部分细菌会被氯杀灭.清水池水样中，在0.6 mg/L的余氯条件下，细菌数目还会继续增加，这说明在高质量浓度余氯生长的细菌大多比较耐氯.虽然主体水中的细菌灭活率要小于生物膜中的细菌灭活率，但生物膜中细菌数目高于主体水中细菌数目3～5个数量级，生物膜中耐氯菌数目也一般高于主体水的耐氯菌数目2个数量级，因此，在生物膜中更容易发现耐氯菌.由于生物膜中存在诸如胞外聚合物(EPS)等复杂的组分和更多的群体细菌数目，减少了消毒剂在生物膜基质中的扩散限制和反应抑制作用，使得生物膜中细菌具有更强的抗氯性［18］.本研究在检测生物膜中的耐氯菌时，首先通过超声波和漩涡振荡法分散细胞群体生物膜，使生物膜中的个体细胞释放出来，尽量减少消毒剂在生物膜基质中的扩散限制和反应抑制作用，也尽量使“真正”的耐氯细菌能得以检出.

图4 供水系统主体水和生物膜悬浮液中细菌灭活率的对比

管网生物膜是主体水微生物的的主要来源，是导致水质恶化的主要原因［9，22］.然而从供水系统中完全去除生物膜几乎是不可能的［9］，可以从以下几个方面来控制和减少生物膜的生长:采用深度处理工艺降低出厂水的营养物质，采用UV+液氯联合消毒降低出厂水的微生物数量，提高余氯质量浓度，管网中二次加氯，增大管网内的水流速，在用户入管尽量采用不锈钢和PE材质的管道材料;对于已经产生较多管网生物膜的区域，可以定期进行消毒剂+冲洗联合清洗方式去除大部分生物膜，在用户终端采用一些水净化和消毒(UV 或 O3)装置［4，9，15，26］.

2.3 供水系统生物膜扫描电镜观察

供水系统6个样品生物膜的扫描电镜观察结果见图5.可以看出，在水厂滤池反冲洗前期废水的颗粒中能明显看到微生物，能见杆菌和球菌，以杆菌居多，经加氯消毒后在清水池池壁上未观察到微生物.出厂水在管网输送过程中，生物膜中的微生物细胞数目随着输送距离的增加有增多的趋势.在管网的中末端，镀锌铁和水泥瓷砖材料上的生物膜中微生物数量较多，且能见细菌团聚的形式存在，并形成了明显的腐蚀瘤.电镜照片显示腐蚀瘤内部是丰富的微生物，亦能见杆菌和球菌，以杆菌居多.玻璃钢材料上的生物膜中微生物数量也较多，而PPR管材上的生物膜中微生物数量相对较少，这可能是因为只经过了很短的管网输送(300 m).上述观察结果与细菌总数趋势完全一致.而在微生物种类上，这几种材料上生物膜中的微生物均能见杆菌和球菌，以杆菌居多.王薇等［27］和张向谊［28］等研究给水管网管壁微生物生长特性时发现，给水管网管壁中的微生物以球菌和杆菌为主，与本文研究结果基本一致.从电镜照片上看，不同材料上附着的生物膜的微生物形态相对比较接近，能见杆菌和球菌，以杆菌居多，差异不明显.

图5 供水系统生物膜扫描电镜观察结果

3 结论

1)细菌再生长现象随着供水管线的延长有增大的趋势，但相关不显著.供水管网中细菌数目与管材、管龄相关度不明显，在新管网(管龄1～4 a)中细菌再生长现象仍然很普遍，很严重.供水管网中细菌数目与消毒剂质量浓度呈一定的负相关.

2)耐氯菌在该供水系统中普遍存在，生物膜中耐氯菌数目一般高于主体水中2个数量级.在清水池高质量浓度余氯环境下生长的细菌大多比较耐氯.

3)不同供水材料上生物膜的微生物形态能见杆菌和球菌，以杆菌居多.

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