澳洲茄碱诱导肺癌细胞株H446凋亡及其机制探讨

黄文斯 王颖 朱海涛 吴荧荧 谢晓东 王冬青

原发性支气管肺癌分小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC），其中SCLC占20%左右。在肿瘤中肺癌的发病率和病死率最高，且其发病率在全球范围内居高不下[1]。肿瘤的发生发展不仅与细胞增殖失控有关，还与细胞凋亡受阻相关，即增殖凋亡失衡的结果，其决定了肿瘤的生长速率，放疗和化疗可引起细胞坏死，一般的激素制剂、抗癌药物等是通过诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制，从而达到治疗的目的。可见凋亡不仅在正常机体的正常发育、分化及死亡中产生重要影响，而且在肿瘤治疗方面也发挥重要作用，深受重视[2,3]。多种中草药中，有些药已证明对肿瘤细胞有抑制作用。我国是个天然的药物大国，中草药的应用历史悠久，在治疗的药物中，抗肿瘤中成药的不良反应较小，因此抗肿瘤中成药成为了人们关注的治疗方法[4]。澳洲茄碱提取于中药龙葵，龙葵还包括龙葵碱（solanine）、澳洲茄边碱（solamargine,SM），其为茄科草本植物，富含多种甾体生物碱，而生物碱类化合物多能促进肿瘤细胞的凋亡，肿瘤细胞凋亡通路的受阻与肿瘤的发生发展紧密相关[5,6]。澳洲茄碱作用于肺癌的报道尚少，本研究旨在探讨澳洲茄碱对肺癌H446细胞凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 澳洲茄碱（纯度＞98%）为上海亿林生物科技有限公司产品，胎牛血清（fetal calf serum,FBS）购于GIBCO公司，CCK8试剂、Annexin V/PI 凋亡试剂盒均购于南京诺维赞生物技术有限公司，β-actin、CASP3、BAX、BCL2及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗则购于武汉博士德生物工程有限公司，分子净化工作台（苏州生化净化设备厂），CO2培养箱及酶标仪（Thermo公司），显微镜（Olympus 公司），流式细胞仪（Becton Dickinson公司）。

1.2 细胞培养 人肺癌H446细胞以10%胎牛血清的DMEM培养基(含青、链霉素各100 U/mL) ，于37 ℃和5%CO2的细胞培养箱中进行培养。细胞单层贴壁状态，取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 CCK8试剂检测细胞活性 收集呈对数生长的H446细胞，制成浓度为2.5×104/mL的单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔细胞数为5×103个。细胞培养24 h后，弃原培养液，实验组每孔加入200 μL澳洲茄碱，浓度分别为0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L、27.2 μmol/L，只加培养基无细胞孔作空白对照组，每组设置5个复孔。将4块96孔板置于培养箱中分别培养3 h、6 h、12 h、24 h，弃原培养液，PBS洗一遍后，每孔中加入100 μL的CCK8与无血清培养基的混合液（比例1:10），于37 ℃避光孵育1 h，在酶联免疫监测仪上以450 nm波长测定各孔吸光度（optical density, OD）值，记录并计算存活率及抑制率。

1.4 倒置显微镜观察细胞形态及DAPI核染后核变化H446细胞培养于6孔板中，每孔1×105个，0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L的澳洲茄碱作用24 h后，用PBS清洗两遍，4%多聚甲醛固定15 min，用0.1%triton-X 100处理5 min后每孔加入浓度为1 μg/mL的DAPI染液，常温避光孵育10 min，后用PBS清洗3遍后，于倒置显微镜观察细胞形态变化，荧光显微镜观察细胞核的变化。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 将H446细胞常规培养于6孔板中，每孔1×106，贴壁后与浓度为0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6μmol/L的澳洲茄碱共培养24 h。消化后离心5 min、1,000 rpm，用预冷的PBS洗涤2遍，重悬细胞于100 μL的Annexin V结合缓冲液中，向每孔缓冲液中加入5 Ml Annexin V和 5 Ml PI，将细胞放置室温下15 min，后向每孔中再加入400 μL的缓冲液，轻轻混匀，1 h内上机，记录并分析结果。

1.6 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测凋亡相关蛋白的表达 以不同浓度（0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L）的澳洲茄碱处理H446细胞，24 h后收集，加入细胞裂解液（内含蛋白酶抑制剂和PMSF），震荡离心，取上清测总蛋白量，100 ℃煮沸10 min后置于-20 ℃保存。每组取蛋白样品40 μg，于10%SDS-PAGE进行电泳，电泳后将凝胶的蛋白转移到PVDF膜上，将膜置于5%的脱脂奶粉中，常温下进行封闭处理1 h，孵育1:500稀释的抗体BCL2、BAX和CASP3，4 ℃过夜。膜经TBST（150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris, 0.1%Tween-20, pH7.6）洗涤3次，每次10 min，加入相应辣根过氧化物酶标记的二抗（1:2,000）常温孵育1 h，再次经TBST洗涤3遍，每次5 min，用ECL化学发光液进行曝光[7]。

1.7 统计学分析 统计数据采用SPSS 16.0统计学软件进行分析，实验数据中计量资料用均数±标准差（Mean±SD）表示。多样本比较使用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 澳洲茄碱抑制H446的增殖 通过CCK8实验的数据分析，浓度3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L、27.2 μmol/L加药组24 h细胞存活率分别为85.64%、64.68%、20.96%、16.77%，差异有统计学意义（P＜0.001）（图1），经过简单计数，对照组与浓度3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L、27.2 μmol/L加药组的细胞个数分别为5,000个/孔、4,326个/孔、3,328个/孔、1,248个/孔和998个/孔，与CCK8所得结果相近。

2.2 澳洲茄碱诱导H446细胞凋亡 倒置显微镜观察，浓度为0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L的澳洲茄碱作用于H446细胞24 h后，对照组细胞形态正常，细胞核完整，而加药组细胞体积变小，核皱缩，轮廓不规整。DAPI染核后通过荧光显微镜观察，药物浓度越大，核变化越大，以13.6 μmol/L组变化最明显，细胞核固缩，边集（图2）。流式细胞分析仪检测的结果，0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L的澳洲茄碱作用24 h后可出现细胞凋亡现象，流式细胞术检测的凋亡率与正常对照组相比明显增高，以浓度为13.6 μmol/L的作用尤为明显（P＜0.001）（图3）。

2.3 澳洲茄碱影响凋亡相关蛋白的表达 通过Western blot法可观察到，随着药物浓度的增加，凋亡相关蛋白BAX、CASP3表达量增加，而凋亡抑制基因蛋白BCL2表达量减少，均以浓度为13.6 μmol/L的药物作用明显（P＜0.001）（图4）。

图1 CCK8检测澳洲茄碱对H446细胞的增殖作用。分别用浓度为0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L、27.2 μmol/L的澳洲茄碱作用于H446细胞，于3 h、6 h、12 h、24 h用CCK8试剂检测。单因素方差分析，3 h、6 h、12 h、24 h的不同浓度与对应的对照组比较均有统计学意义，***：P≤0.001。Fig1 Detect proliferation of H446 by CCK8. With concentration of 0 μmol/L, 3.4 μmol/L, 6.8 μmol/L, 13.6 μmol/L, 27.2 μmol/L of solanine, CCK8 detected the proliferation of H446 cells in 3 h, 6 h,12 h and 24 h. It had statistical significance compared with the corresponding controls in 3 h, 6 h, 12 h and 24 h analyzed with one-way analysis of variance, ***: P≤0.001.

图2 澳洲茄碱作用于H446细胞后细胞形态学变化（×100）。浓度为0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L的澳洲茄碱作用于H446细胞24 h后对细胞形态的观察及DAPI染色后观察细胞核的变化。Fig2 Change of cell morphology in H446 cells by solanine (×100). Incubated with 0 μmol/L, 3.4 μmol/L, 6.8 μmol/L, 13.6 μmol/L solasonine for 24 h, then detected the changes of H446 cells’ morphology and nucleus staining by DAPI.

图3 流式细胞术检测澳洲茄碱作用于H446细胞后的凋亡率。A：浓度为0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L的澳洲茄碱作用于H446细胞24 h后流式细胞术检测细胞凋亡率；B：细胞凋亡结果单因素方差分析，结果具有统计学意义。***：P＜0.001。Fig3 Detection of apoptosis rate of H446 cells incubated with solanine by flow cytometry. A: H446 cells was incubated with 0 μmol/L, 3.4 μmol/L, 6.8 μmol/L, 13.6 μmol/L of solanine for 24 h, apoptosis rate was detected by flow cytometry; B: The results analyzed by Oneway analysis of variance showed that it had statistical significance. ***: P＜0.001.

图4 Western blot检测细胞凋亡相关蛋白的变化。A：用浓度为0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L的澳洲茄碱作用于H446细胞24 h后检测细胞内凋亡相关蛋白BCL2、BAX和CASP3表达量的变化；B、C和D：BCL2,BAX和CASP3蛋白Western blot灰度单因素方差分析表明，结果具有统计学意义。*：P＜0.05；***：P＜0.001。Fig4 Changes of apoptosis-related proteins detected by Western blot.A: After incubated with 0 μmol/L,3.4 μmol/L, 6.8 μmol/L, 13.6 μmol/L of solanine, western blot was used to detect the changes of apoptosis-related proteins BCL-2,BAX and CASP3 in H446 cells; B,C and D: The one-way analysis of variance results showed that it had statistical significance. *: P＜0.05;***: P＜0.001.

3 讨论

澳洲茄碱提取于龙葵，有文献[8,9]报道龙葵可抑制细胞突变，在肿瘤生长及增殖方面也有抑制作用，其可促进肿瘤细胞凋亡，并可抑制肿瘤转移，恢复细胞正常生理活动，增强机体免疫功能，调节机体免疫的同时具有细胞毒性作用。肺癌用中医解释，则为体内正气不足而邪毒外侵，所致气血瘀滞，内聚浊痰，故出现咳嗽咳痰、胸痛咯血等症状。龙葵恰好具有清热解毒、活血消肿的功效[10]，而澳洲茄碱作为龙葵的主要成分之一，也许可成为一个治疗肺癌的新方向。

肿瘤的发生和发展与肿瘤细胞的增殖凋亡失衡密切相关。在细胞的生理活动中，增殖与凋亡处于平衡状态，而凋亡是细胞死亡的主要调控程序[11]，人体中突变细胞的异常增殖、细胞凋亡的异常调节可促进肿瘤的发生。

本研究通过CCK8实验筛选出澳洲茄碱对H446细胞增殖抑制作用浓度及合适时间。实验得出澳洲茄碱对H446细胞的增殖抑制作用具有明显的浓度依赖性，而浓度为13.6 μmol/L与27.2 μmol/L作用相近，故在后续实验中选择0 μmol/L、3.4 μmol/L、6.8 μmol/L、13.6 μmol/L四个浓度。而实验筛选出的作用时间，不具有明显的时间依赖性，但以24 h作用抑制增殖效果最强，故选用24 h作为实验的最佳时间。上述实验结果表明，澳洲茄碱可降低H446细胞的存活率，减少其增殖，从而进一步对H446细胞凋亡产生作用。

澳洲茄碱对肺癌细胞H446凋亡的影响，通过对细胞形态学的观察、流式细胞术及凋亡相关蛋白（BCL2、BAX、CASP3）表达情况阐述其作用机制。

细胞形态学结果表明，澳洲茄碱作用于H446细胞后，细胞出现皱缩，细胞核固缩、边集、凋亡小体形成等细胞凋亡的表现，以药物浓度为13.6 μmol/L最明显，而对照组未见明显细胞形态变化；流式细胞术AnnexinVFITC标记法对细胞凋亡比例的测定结果显示，澳洲茄碱可促进H446细胞的凋亡，并呈明显的浓度依赖，细胞早晚期凋亡率均升高。对凋亡相关蛋白（BCL2、BAX、CASP3）而言，BCL2家族是细胞凋亡信号转导的关键因素，其中BCL2是抑制凋亡基因的代表，而BAX是促进凋亡的基因，二者在肿瘤细胞凋亡程序中具有重要调控作用[12,13]；CASP家族在细胞凋亡机制中占中心地位，其中CASP3是最重要的凋亡执行者，它活化后标志了细胞进入不可逆的凋亡阶段[14,15]。本研究通过将澳洲茄碱作用于H446细胞后，应用Western blot实验得出抑制凋亡的基因代表BCL2表达下调，而CASP3表达上调，从而说明细胞处于凋亡不可逆状态，而BAX促凋亡基因编码的BAX蛋白增加进一步说明细胞走向凋亡。

综上所述，澳洲茄碱通过抑制H446细胞增殖，增加H446细胞的凋亡率，激活促凋亡基因，从而进一步上调促凋亡基因蛋白的表达并下调抑凋亡蛋白的表达，这可能是澳洲茄碱诱导肺癌细胞H446的凋亡机制。通过本研究及其他报道的实验结果，澳洲茄碱在临床肿瘤的治疗上可能有潜在的发展，值得进一步研究。