反胶团法提取葡萄籽蛋白质的工艺研究

黄晓辉，茹晶晶，罗五魁，郭彩云

(宁德师范学院)

0 引言

据统计，我国年产葡萄约100万吨，其中80%的葡萄用于酿酒.在酿酒的同时将产生大量的葡萄籽［1］，葡萄籽中含有大量的脂肪、蛋白质、碳水化合物及其他营养保健物质［2］.目前对葡萄籽蛋白质的提取利用报道极少［3］.传统的蛋白质分离方法，有等电点沉淀和pH调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法等方法.但这些方法很难用于具有某些特殊性质的生化产品的提取与分离，原因在于这类物质多数不溶于非极性有机溶剂［4－6］.20世纪80年代发展起来的反胶团萃取技术解决了这难题，反胶团法萃取蛋白质的优点主要是萃取率高并具有选择性;过程简单;能解决蛋白质在非细胞环境中迅速失活的问题;溶剂可反复使用、成本低廉［7］.

该课题拟用十六烷基三甲基溴化铵(CATB)/异辛烷/正丁醇反胶团体系萃取葡萄籽蛋白质，并探讨了反胶团葡萄籽蛋白的萃取工艺条件，为进一步开发葡萄籽植物蛋白新资源提供实验依据.

1 材料与试剂

十六烷基三甲基溴化铵(CATB)、异辛烷、正辛醇、氯化钾、磷酸氢二钠、柠檬酸、乙醇、磷酸85%、牛血清蛋白标准品、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、硼酸、甲基红指示剂、氢氧化钠、95%乙醇(以上均为分析纯 天津市福辰化学试剂厂)，VIS－7220型分光光度计(北京瑞丽分析仪器公司)，DHG－9001A型电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，pHS－25W数显pH计(上海雷磁创益仪表有限公司)，电子天平 AR124CN(奥豪斯仪器(上海)有限公司)，KQ－250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司).

2 实验内容

2.1 测定葡萄籽中总蛋白质含量

用凯氏定氮法［8］测定葡萄籽中总蛋白质含量.

2.2 反胶团法萃取葡萄籽中的蛋白质

称取适量CATB将其置于250 mL锥形瓶中，加入一定体积的异辛烷与正辛醇(体积比为4∶1)的混合溶剂、一定浓度KCl和一定pH的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲溶液［8］.向上述反胶团溶液中加入一定量葡萄籽粉(精确到0.0001 g)将锥形瓶置于超声波清洗器超声一段时间，超声波清洗后所得混合物倒入离心管中进行离心分离出去残渣［9］，所得清液用考马斯亮蓝G－250法测定溶液中的蛋白质含量.

3 结果与分析

3.1 考马斯亮蓝标准曲线［10］

按文献［10］方法测定考马斯亮蓝标准曲线，曲线的线性方程为y=0.0006x+0.0192，其中x为蛋白质质量浓度，y为吸光度，R2=0.9924，说明该曲线符合线性相关，且线性关系良好.

3.2 单因素试验

3.2.1 pH对蛋白质萃取率的影响

按照2.2步骤，分别调节水相不同的pH，计算不同pH下的葡萄籽蛋白质萃取率，结果如图1所示:

图1 pH对蛋白质提取率的影响

由图1可以看出，pH在3～6之间，蛋白质的萃取率随着pH的升高而升高.而pH在7～9之间，蛋白质萃取率随着pH的升高而降低.所以选取pH为6.00.

3.2.2 KCl浓度对蛋白质萃取率的影响

按照2.2步骤调节水相pH为6.00，调节不同KCl的浓度;计算在不同KCl盐浓度下的葡萄籽蛋白质萃取率;结果如图2所示.

图2 KCl浓度对蛋白质萃取率的影响

由图2可以看出，在KCl浓度范围为0.02～0.06 mol/L时，葡萄籽蛋白质萃取率随着KCl浓度的升高而升高.当 KCl浓度范围为0.06～0.18 mol/L时，葡萄籽蛋白质萃取率随着KCl浓度的升高反而降低.当 KCl浓度为0.06 mol/L时葡萄籽蛋白质的萃取率达到最高.

3.2.3 葡萄籽加入量对蛋白质萃取率的影响

按照2.2步骤加入不同的葡萄籽原料量，计算各原料量下的葡萄籽蛋白质萃取率;葡萄籽原料量从0.6000 g增加到1.4000 g，葡萄籽蛋白质萃取率随着原料量的增加而减少.综合考虑有效利用反胶团溶液，所以选取加入原料量为0.6000 g.

3.2.4 萃取时间对蛋白质萃取率的影响

按照2.2步骤在不同的时间萃取;计算各萃取时间下的萃取率;当时间为20～60 min，随着时间的增加蛋白质萃取率也在提高，60 min以后蛋白质萃取率的变化变为平缓.综合考虑选取萃取时间为60 min.

3.3 正交试验结果

3.3.1 因素水平的选取

根据单因素试验结果，选取4个因素做正交试验，见表1.

表1 正交试验因素水平

在进行反胶团法萃取葡萄籽蛋白质的单因素分析的基础上，进行了L9(34)正交实验，对最佳提取工艺参数进行探讨，正交实验见表2.

表2 正交试验结果

对上述正交试验结果进行分析，影响蛋白质萃取率的各因素主次关系是:pH＞离子强度＞萃取时间＞原料量;最佳萃取条件为:离子强度0.07 mol/L，pH 为 6.00，温度为 50℃时，原料量为0.4000 g.在最佳工艺条件下，萃取率可达68.32%.

4 结论

通过单因素实验，发现葡萄籽蛋白质萃取受离子强度、萃取时间、pH、原料量的影响突出.通过正交实验可得:最优的工艺参数为:离子强度0.07 mol/L，pH 为6.00，温度为50 ℃时，原料量为0.4000 g，萃取率可达到 68.32%.这说明以CTAB/异辛烷/正辛醇反胶团体系萃取葡萄籽蛋白质可行的.

［1］吉宏武.葡萄酒厂下脚料的综合开发利用途径［J］.食品研究与开发，2000(1):29－31.

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［3］何秀珍，张慧祥，罗玉洁，等.山葡萄籽蛋白的提取和分析［J］.食品科学，1989(8):20–21.

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［8］王家政，范明.蛋白质技术手册［M］.北京:科学出版社，2003.193–194.

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［10］杭州大学化学系分析化学教研室.分析化学手册:第二分册［M］.北京:化学工业出版社，1982.45–48.