胃癌患者Th17/Treg细胞失衡的研究

2015-09-14 03:12李清靖单保恩李宏苏景伟张超李巧霞
中国全科医学 2015年29期
关键词:外周血进展比例

李清靖,单保恩,李宏,苏景伟,张超,李巧霞

胃癌患者Th17/Treg细胞失衡的研究

李清靖,单保恩,李宏,苏景伟,张超,李巧霞

目的检测Th17和Treg细胞在胃癌患者外周血中的分布,探讨Th17/Treg细胞免疫平衡与胃癌发生发展的关系。方法选取2010年7月—2011年9月河北医科大学第四医院住院的胃癌患者45例作为病例组,另选取同期本院健康体检者20例作为对照组。取受试者外周血5 ml,分离单个核细胞,采用流式细胞分析技术检测细胞的表达,以产生IL-17的为Th17细胞,以细胞为Treg细胞,检测Th17和Treg细胞的数量和比例。结果流式细胞术检测结果显示,病例组外周血Th17细胞比例、Treg细胞比例、Th17/Treg均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。对照组中,外周血Th17细胞比例与Treg细胞比例呈正相关(r=0.64,P=0.003);病例组中,外周血Th17细胞比例与Treg细胞比例无直线相关性(r=0.12,P=0.490)。多元线性回归分析结果显示,Th17细胞比例升高与TNM分期(P=0.002)、淋巴结转移(P=0.017)有关;Treg细胞比例升高与TNM分期(P=0.034)、分化程度(P=0.015)有关;Th17/Treg升高与淋巴结转移有关(P=0.036)。结论胃癌患者Th17、Treg细胞比例及Th17/Treg明显增高,并与患者TNM分期、淋巴结转移、肿瘤分化程度有关,提示胃癌患者存在Th17/Treg细胞免疫平衡失调,这种失调可能促进了胃癌的进展。

胃肿瘤;Th17细胞;T淋巴细胞,调节性;免疫平衡

李清靖,单保恩,李宏,等.胃癌患者Th17/Treg细胞失衡的研究[J].中国全科医学,2015,18(29):3596-3600.[www.chinagp.net]

Li QJ,Shan BE,Li H,et al.Imbalance of Th17/Treg in patients with gastric cancer[J].Chinese General Practice,2015,18(29):3596-3600.

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一。世界范围内,每年约有100万新发病例,病死率约为50%,其发病率居全部恶性肿瘤的第3位,居消化道恶性肿瘤的首位。幽门螺杆菌(H.pylori,HP)被定为胃癌的Ⅰ类致癌因子,流行病学研究表明HP感染与慢性胃炎、胃癌的发生密切相关。细胞在HP感染的免疫应答中发挥重要作用[1],大多数HP感染被体液免疫和细胞免疫清除[2]。说明免疫调节作用在HP介导的致癌作用中发挥关键作用。

根据细胞因子的产生及其功能,Th17和Treg细胞被认为是不同于Th1和Th2细胞的细胞亚群。研究表明Th17细胞及其效应因子在炎症、自身免疫疾病和过敏反应中发挥重要作用[3-5]。但是Th17细胞在癌症中的作用尚不十分清楚。并且,在不同类型肿瘤或不同的机体免疫背景下,Th17细胞在肿瘤的发生发展中可能起着双向作用。Treg细胞特征性表达Foxp3转录因子,是具有免疫抑制作用的T细胞亚群,通过接触抑制或释放抗炎细胞因子白介素10(IL-10)和转化生长因子β(TGF-β)诱导T细胞耐受[6],这些功能不利于肿瘤免疫监视作用和抗肿瘤免疫[7]。

Th17和Treg细胞之间的平衡控制了免疫应答,是辅助性T细胞作用于自身免疫疾病和移植物抗宿主病的重要调节因素[8]。然而,在癌症患者中关于Th17和Treg细胞之间平衡的研究还非常有限。为了评估在胃癌患者中Th17/Treg平衡是否被打破及其与胃癌发病和进展的关系,本研究采用流式细胞分析技术检测Th17/ Treg细胞在胃癌患者外周血中的分布,探讨Th17/Treg细胞免疫平衡与胃癌发生发展的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2010年7月—2011年9月河北医科大学第四医院住院收治的胃癌患者45例作为病例组,其中男36例,女9例;年龄24~74岁,平均年龄44岁。患者均经组织学证实,TNMⅠ期15例,Ⅱ期9例,Ⅲ期9例,Ⅳ期12例;高分化14例,低分化31例;无淋巴结转移27例,有淋巴结转移18例;肿瘤直径<4 cm 19例,≥4 cm 26例;浸润深度<15mm 17例,≥15 mm 28例;无血管侵袭34例,有血管侵袭11例;无脉管瘤栓36例,有脉管瘤栓9例。排除合并糖尿病、高血压、心血管疾病、妊娠、急慢性感染、结缔组织疾病和既往其他恶性肿瘤史者。患者均未行免疫抑制、放化疗等治疗。另选取同期本院健康体检者20例作为对照组,其中男13例,女7例;年龄26~65岁,平均年龄41岁。

1.2 实验方法

1.2.1 分离单个核细胞取受试者外周血5 ml,加入等量磷酸盐缓冲液(PBS)稀释,轻轻颠倒混匀。另外取50 ml离心管,加入ficoll分离液10 ml,将PBS稀释的外周血轻轻沿管壁滴加到ficoll的液面上,使分界面保持清晰,采用水平离心机以2 100 r/min离心30 min,离心半径16 cm,细胞出现分层:上层为血浆和血小板等,下层主要为红细胞及中性粒细胞等,中间为云雾状单个核细胞层,小心吸出云雾状层面,转移到另一离心管中,加入PBS,混合均匀,采用水平离心机以1 500 r/min离心10 min,离心半径16 cm,重复洗涤1次,弃尽上清液,加入适量含有10%新生小牛血清的1640培养基,重悬细胞,显微镜下计数,调整细胞浓度为2× 106/m l。

1.2.2 铺板将调整好浓度的细胞培养到24孔板中,每孔1 ml,加入PMA、ionomycin、BFA,使其终浓度分别为50 pg/L、1μg/ml和10μg/ml(PMA和ionomycin是药理学的T细胞活化因子,模拟信号由TCR复合物产生,有利于刺激T细胞的抗原特异性;BFA用来阻止胞内运输,因此导致细胞因子在细胞内积累)。将细胞放入细胞培养箱,在37℃,5%CO2的条件下刺激培养4 h,留待流式标记及分析。

1.2.3 流式细胞术检测Th17细胞的表达收集细胞,PBS洗涤1次,将细胞分装于不同管中,每管100μl,各测定管分别加入FITC-Anti-Human CD4,同型对照管加入等量的同型对照抗体,用于调节荧光补偿和确认抗体的特异性。避光,4℃,孵育30 min进行细胞膜染色;PBS洗涤1次,100μl PBS重悬细胞,每管加入新鲜配制的Fixation/Permeabilization工作液1 ml,避光,4℃,孵育30~45 min,2 m l 1×Permeabilization Buffer洗涤两次,测定管加入PE-Anti-Human IL-17A,同型对照管加入等量的同型对照抗体,避光,4℃,孵育30 min,2 ml 1×Permeabilization Buffer洗涤两次,0.5 ml PBS重悬细胞,流式细胞仪检测,以细胞设门分析细胞中IL-17+细胞比率。本研究中,每一个样本收集分析1×106个细胞,Th17细胞比例以IL- 17+在细胞中的百分比表示。

1.2.4 流式细胞术检测Treg细胞的表达收集细胞装管同上,各测定管分别加入FITC-Anti-Human CD4和APC-Anti-Human CD25避光,4℃,孵育30 min染细胞膜;PBS洗涤1次,100μl PBS重悬细胞,每管加入新鲜配制的Fixation/Permeabilization工作液1 m l,避光,4℃,孵育30~45 min,应用1×Permeabilization Buffer,2 ml洗涤两次,用正常大鼠血清封闭15 min,测定管加入PE-Anti-Human Foxp3,同型对照管加入同等量的PE-rat IgG2a,避光,4℃,孵育30~45 min,2 ml1× Permeabilization Buffer洗涤两次,0.5 m l PBS重悬细胞,流式细胞仪检测,以细胞设门分析细胞中细胞比率。本研究中,每一个样本收集分析1×106个细胞,Treg细胞比例以在细胞中的百分比表示。

1.3 统计学方法采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,计量资料以(±s)表示,组间比较采用t检验;采用Pearson相关分析Th17与Treg细胞的相关性。采用多元线性回归分析Th17、Treg比例、Th17/Treg与患者临床病理特征之间的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血中Th17、Treg、Th17/Treg比较流式细胞术检测结果显示,病例组外周血Th17、Treg细胞比例及Th17/Treg均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。

表1 两组Th17、Treg细胞比例以及Th17/Treg比较(±s)Table 1 Comparison of the proportions of Th17 and Treg cells and Th17/ Treg between the two groups

表1 两组Th17、Treg细胞比例以及Th17/Treg比较(±s)Table 1 Comparison of the proportions of Th17 and Treg cells and Th17/ Treg between the two groups

组别例数Th17细胞比例(%) Treg细胞比例(%)Th17/Treg对照组20 1.63±0.10 4.79±0.18 0.34±0.03病例组45 6.67±0.77 10.34±1.13 0.65±0.05 t 值29.04 21.75 25.68 P值<0.001<0.001<0.001

2.2 相关性分析对照组中,外周血Th17与Treg细胞比例呈正相关(r=0.64,P=0.003,见图1);病例组中,外周血Th17与Treg细胞比例无直线相关性(r= 0.12,P=0.490,见图1)。

2.3 多元线性回归分析分别以病例组Th17细胞比例、Treg细胞比例、Th17/Treg为因变量,以临床病理特征性别、年龄、TNM分期、分化程度、淋巴结转移、肿瘤直径、浸润深度、血管侵袭、脉管瘤栓、胃癌相关肿瘤抗原(CA50、CEA、CA199、CA724)为自变量进行多元线性回归分析,结果显示,Th17细胞比例升高与TNM分期(P=0.002)、淋巴结转移(P=0.017)有关,与性别、年龄、分化程度、肿瘤直径、浸润深度、血管侵袭、脉管瘤栓、胃癌相关肿瘤抗原无关(P>0.05,见表2)。Treg细胞比例升高与TNM分期(P =0.034)、分化程度(P=0.015)有关,与性别、年龄、肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移、血管侵袭、脉管瘤栓、胃癌相关肿瘤抗原无关(P>0.05,见表2)。Th17/Treg升高与淋巴结转移有关(P=0.036),与性别、年龄、TNM分期、肿瘤分化程度、肿瘤直径、浸润深度、血管侵袭、脉管瘤栓、胃癌相关肿瘤抗原无关(P>0.05,见表2)。

图1 Th17细胞比例和Treg细胞比例的相关性分析Figure 1 Correlation between Th17 and Treg cells proportion

3 讨论

免疫逃逸在肿瘤发展中发挥决定性的作用[9]。产生免疫逃逸的机制已经被广泛研究,其中包括T细胞抑制或功能障碍[10-11]。Th17细胞为细胞亚群,在Treg细胞分化中起负调节作用[12-16]。有研究在鼠和人类肿瘤组织中均发现了Th17细胞[12,17-18]。但是Th17细胞在肿瘤免疫中的性质和作用尚不十分清楚。Zhang等[18]发现,在前列腺癌和卵巢癌外周血中Th17细胞明显增多,另外Th17细胞的功能性细胞因子IL-17血清水平明显增高。本试验也发现胃癌患者中Th17细胞比例显著增高,因此,Th17细胞亚群在肿瘤的发生和进展中可能发挥重要作用。近来,CCR4和CCR6被认为是Th17细胞的两种特征性的趋化因子受体。这些分子的高表达可能与Th17细胞在肿瘤中的迁移和定位有关[19-20]。这些结果表明外周血Th17细胞可能是肿瘤浸润Th17细胞的重要来源。

最近有证据表明,IL-17通过上调多种促血管生成因子[11],在肿瘤的血管生成和进展中发挥重要作用[21]。Th17细胞作为IL-17的主要来源[12],免疫组化研究发现肿瘤内Th17细胞的水平与组织中微血管密度呈正相关,微血管密度的增加预示着预后不良[19]。因此,除了诱导产生免疫耐受外,肿瘤还可以使促炎性反应远离抗肿瘤免疫,向血管生成和组织重塑途径来促进肿瘤发展。本研究中发现,Th17细胞比例的增多与患者临床分期、淋巴结转移有关,因此,Th17细胞可能会间接导致胃癌患者的恶性发展和存活率降低。Zhang等[22]在胃癌的研究中也得到了相似的结论。既往研究显示随着肿瘤的进展,Treg和Th17细胞逐渐增加,在进展期肿瘤中达到最高水平[22-23]。因此,肿瘤可能会打破宿主的免疫平衡,使Th17和Treg细胞比例失衡,向肿瘤区域运输,并随着疾病进展逐渐积累[3]。因此,局部富含的Treg和Th17细胞通过诱导免疫抑制和血管生成促进肿瘤进展。

表2 Th17、Treg细胞比例和Th17/Treg与胃癌患者临床病理特征的多元线性回归分析Table 2 Multivariate linear regression analysis on the influence of clinical pathological features for Th17,Treg and Th17/Treg in gastric cancer patients

Treg细胞自发现后,因其对T细胞免疫应答有很强的免疫抑制活性,所以在抗肿瘤免疫中得到广泛关注[9,24]。越来越多的证据表明,在癌症患者中Foxp3+Treg细胞增多,大量的Treg细胞导致了患者的低存活率[10,23,25]。本研究证明胃癌患者PBMCs中Treg细胞比例明显增高。实际上,关于卵巢癌[26]和前列腺癌[27]的研究证明PBMCs中Treg细胞比例显著增高,在癌症早期和进展期之间有明显差别。本研究中Treg细胞比例增加与胃癌患者临床分期、肿瘤分化有关,但是胃癌患者早期和进展期Treg细胞比例有无差异,还需大量的研究证实。淋巴细胞的迁移与趋化因子受体密切相关[19,28-29]。近来研究发现,大多数肿瘤相关的Treg细胞表达淋巴回巢因子CD62L,CCR4和CCR6,这些因子诱导Treg细胞在肿瘤引流淋巴结和随着疾病的进展逐渐增多[6,10,18,22,27]。提示肿瘤浸润的Treg细胞可能来源于外周血。Nakamura等[23]发现一部分原位癌已经具有了免疫调节能力,肿瘤细胞自身开始分泌炎症趋化因子从外周血中招募Treg细胞[26]。这一发现意味着免疫微环境在胃癌早期可能发生改变,Treg细胞比例增高,开始向肿瘤部位运输,随着肿瘤的发展逐渐积累。

肿瘤的进展是各种类型细胞相互作用的产物[30]。Th17/Treg亚群与Th1/Th2细胞亚群均参与了机体的免疫调节过程[31],而且Th17/Treg免疫失衡会导致肿瘤进展。本研究结果支持了这一观点,结果显示,健康人Treg细胞与Th17细胞比例呈正相关,但胃癌患者两者无相关性,这也许反映了在健康人中存在Th17/Treg免疫平衡,但是在胃癌患者中这种平衡被打破。在关于宫颈癌的研究中也得到了相同的结论[32]。进一步分析显示,胃癌患者Th17/Treg比例增高与患者有无淋巴结转移相关,提示Th17/Treg失衡可能在胃癌的发生和进展中发挥重要作用。也有研究报道了Th17和Treg在人类肿瘤中的不同情况[6,17-18],Treg细胞随着肿瘤的进展逐渐增高,但是Th17在早期积累,随着疾病进展逐渐减少,结果在进展期肿瘤中Treg细胞在Th17/Treg平衡中占主导地位。表明在肿瘤患者中确实存在Th17/Treg失衡,而且导致存活率下降。在本研究中,随着肿瘤的进展,Th17/Treg细胞比例逐渐升高,Th17细胞比例增加比Treg细胞显著。这些结果之间的差异可能是由于不同肿瘤之间的性质不同所致。

总之,Th17和Treg细胞随着疾病的进展逐渐增多,导致在胃癌患者中出现失衡状态,提示Th17/Treg失衡在胃癌的发生发展中起重要作用。因此,更好地理解调节Th17/Treg平衡的潜在机制,有利于为胃癌提供新的治疗方案。

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Imbalance of Th17/Treg in Patients W ith Gastric Cancer

LI Qing-jing,SHAN Bao-en,LI Hong,et al.Clinical Laboratory,the Fourth Hospital of HebeiMedical University,Shijiazhuang 050011,China

Objective To investigate the distribution of Th17 and Treg cells in the peripheral blood of patients with gastric cancer and the relation between Th17/Treg immune balance and gastric cancer.M ethods We enrolled 45 patientswith gastric cancer who were admitted into the Fourth Hospital of HebeiMedical University from July 2010 to September 2011 as case group,and we also enrolled 20 healthy controls who received physical examination in the hospital in the same period as control group.We sampled 5ml peripheralblood from each subjectand extractedmononuclear cells.Flow cytometrywas used to determine the expression ofandT cells that produces IL-17 was taken as Th17 cells,andcells were taken as Treg cells.The numbers and proportions of Th17 and Treg cells were examined.Results Flow cytometry analysis showed that case group was higher(P<0.05)than control group in the proportions of Th17 and Treg cells proportion and Th17/Treg ratio.In control group,the proportion of Th17 cellsand the proportion of Treg cellswere positively correlated(r=0.64,P=0.003);in case group,the proportion of Th17 cells and the proportion of Treg cells had no linear correlation(r=0.12,P=0.490).Multipole linear regression analysis showed that the increase of Th17 cells proportion was associated with TNM staging(P=0.002)and lymphatic metastasis(P=0.017);the increase of Treg cells proportion was associated with TNM staging(P=0.034)and differentiated degree(P=0.015);the increase of Th17/Treg was associated with lymphaticmetastasis(P=0.036).Conclusion Patientswith gastric cancer have higher proportionsof Th17 and Treg cells and Th17/Treg ratio,which is associated with TNM staging,lymphatic metastasis and differentiated degree.Patientswith gastric cancermay have Th17/Treg immune imbalance,which may accelerate the progress of gastric cancer.

Gastric neoplasms;Th17 cells;T-lymphocytes,regulatory;Immune balance

R 735.2

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.29.022

2015-03-07;

2015-08-25)

(本文编辑:贾萌萌)

河北省自然科学基金资助项目(C2011206086);河北省卫生厅医学科学研究重点课题(20110456)

050011河北省石家庄市,河北医科大学第四医院检验科(李清靖,李宏),科研中心(单保恩,苏景伟,张超,李巧霞)

李巧霞,050011河北省石家庄市,河北医科大学第四医院科研中心;E-mail:hbydsylqx@126.com

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