高效液相色谱－蒸发光散射检测器法同时测定胆汁槟榔维B1胶囊中鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸含量

何荣芬

(安徽省淮北市人民医院，安徽 淮北 235000)

胆汁槟榔维B1胶囊由猪胆汁提取物、槟榔粉、维生素B1、香兰素组成，临床用于各种便秘，以及由于腹腔炎症、肠粘连、肝胆疾病等致胃肠功能紊乱而引起的腹痛、食欲不振等。其药品标准收载于《国家药品标准·化学药品地方标准上升国家标准(第九册)》[WS－10001－(HD－0861)－2002]，其中有对猪胆汁提取物有效成分的薄层鉴别，但无对其有效成分猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸的含量测定。为了更好地控制产品质量，本研究中采用高效液相色谱法－蒸发光散射检测器(HPLC－ELSD)法检测胆汁槟榔维B1胶囊中猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸的含量。现报道如下。

1 仪器与试药

Thermo U－3000型液相色谱系统;ChromeleonTM7色谱工作站;ELSD 2000ES型检测器;JAC－300型超声波处理器(济宁奥波超声电气有限公司);Mettler AE－240型电子分析天平(0.1mg;0.01 mg);HC－3018型台式高速离心机;SHY－2A型恒温水浴振荡器。鹅去氧胆酸对照品(批号110806－200704;供含量测定用);猪去氧胆酸对照品(批号100087－200610，供含量测定用，供HPLC法测定时含量为97.3%)，均购自中国药品生物制品检定所;胆汁槟榔维B1胶囊(郑州市瑞龙制药股份有限公司，批号分别为 130201，130501，130504，130605);乙腈为色谱纯，冰醋酸为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[1－3]

色谱柱:Thermo C18柱(250mm ×4.6mm，5 μm);流动相:乙腈 －0.1%冰醋酸(53 ∶47);流速:1.0mL/min;柱温:25 ℃;进样量:10μL;检测器条件:漂移管温度105℃，检测器增益为1，撞击管关闭，气体流速2.0 L/min。

2.2 溶液制备

称取猪去氧胆酸对照品55.32mg，鹅去氧胆酸对照品27.87mg，精密称定，同置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得每1mL中含猪去氧胆酸2 153.0μg、鹅去氧胆酸1 114.8μg的混合溶液，作为对照品贮备液[4]。取本品研细，混匀，取细粉约0.08 g，精密称定，置100mL锥形瓶中，加10%氢氧化钠10mL，用牛皮纸将瓶口盖上，置灭菌锅中，于120℃、压力103 kPa加热4 h，放冷，离心，上清液移至100mL容量瓶中，药渣加水3mL，震荡洗涤，离心，取上清液再重复洗涤2次，洗液并入容量瓶中，用盐酸调节pH至6～7，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。按处方称取除猪胆汁膏外的药材粉末0.08 g，按供试品制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

阴性干扰试验:取2.2项下3种溶液，依法进样。在供试品溶液色谱中，与对照品溶液色谱相应位置上有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照品溶液色谱则无此峰出现，表明其他成分不干扰测定，见图1。

线性关系考察:精密量取对照品贮备液 0.5，1.0，2.0，5.0，6.0，置50mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，按上述色谱条件，精密量取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积的自然对数为纵坐标[5]、质量浓度的自然对数为横坐标(μg/mL)进行线性回归，得回归方程为猪去氧胆酸为 Y=1.274 6X－1.946 8(r=0.999 7)，鹅去氧胆酸为 Y=1.162 8X －1.641 5(r=0.999 5)。结果表明，猪去氧胆酸质量浓度在 21.53～258.36μg/mL、鹅去氧胆酸在11.148～133.776μg/mL的范围内与峰面积具有良好的线性关系。

精密度试验:精密量取同一对照品溶液，连续进样5次。结果猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸峰面积的 RSD分别为0.54%和1.60%(n=5)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取同一供试品(批号130201)溶液，每隔2 h进样，记录色谱图。结果猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸峰面积的自然对数RSD为0.77%和1.21%(n=9)，表明供试品溶液在16h内稳定性良好。

重复性试验:取同一批号(批号130201)样品6份，各测定2次，依法制备供试品溶液并测定。结果猪去氧胆酸平均含量为124.193 5 mg/g，RSD 为 1.90%;鹅去氧胆酸的平均含量为97.698 8mg/g，RSD为2.20%。结果表明方法重复性良好。

加样回收试验[6]:称取已知含量的样品(批号130201)，共9份，分成3组，分别精密加入混合对照品溶液(每1mL中含猪去氧胆酸 778.4 μg、含鹅去氧胆酸 756.0 μg)4，5，6mL，置 100mL容量瓶中，按供试品溶液制备方法配制溶液，按拟订条件测定，计算回收率。结果见表1。

图1 高效液相色谱图

表1 猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸加样回收试验结果(n=9)

2.4 样品含量测定

取3批样品，各2份，称取细粉约0.08 g，依法制备供试品溶液，精密量取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，用回归方程计算含量。结果批号为130501，130504，130605的样品中含猪去氧胆酸 125.074 8，124.852 8，126.400 8mg/g，鹅去氧胆酸 97.147 6，99.539 7，101.173 6mg/g。

3 讨论

目前，中国药典收载品种标准及文献[7]报道，多以薄层扫描法测定猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸。由于猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸属甾体类物质，仅有紫外末端吸收，不适合用紫外检测器测定，因此选用ELSD检测。本研究中采用专属性更强、灵敏度更高、操作简单的HPLC－ELSD法对胆汁槟榔维B1胶囊中猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸进行了测定，并对含量测定方法进行了系统考察，结果表明，该方法结果准确、重复性好，可有效控制该制剂的质量。本试验比较30℃，40℃的柱温发现，升高柱温后分离效果、峰形及面积并没有改善，采用20℃的柱温达到了满意效果。通过试验比较105℃和95℃漂移管温度，结果105℃时峰面积达最大。在色谱条件选择的过程中，经试验，乙腈－0.1%冰醋酸(53∶47)为流动相、流速1.0mL/min时分离度大于1.5，样品中其他成分对二者测定无干扰。

[1]唐元军，陈育琳，陈庆辉.HPLC－ELSD法同时测定猪胆粉中猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量[J].中药新药与临床药理，2010，21(6):651－653.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:1 236.

[3]李志万，马 强，袁永生，等.HPLC－ELSD法对猪胆粉中猪去氧胆酸的含量测定研究[J].中国实验方剂学杂志，2005，11(5):14.

[5]麦意梅，于永洲.霍胆丸中猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量测定[J].时珍国医国药，2010，21(10):2 702 －2 703.

[6]盛 燕，陆静娴，赵卫民，等.胆酸止咳片中猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量测定 [J].医药导报，2013，32(12):1 645－1 647.

[7]祝 明，陈必莲.薄层扫描法测定猪胆汁提取物中猪去氧胆酸含量[J].中国药业，2000，9(6):14 －15.