HPLC同时测定加味逍遥丸中栀子苷和芍药苷的含量

杨庆胜，冯朝岭，司根令

(1.河南省医药药材有限公司，河南 郑州 450003；2.河南汉方药业有限责任公司，河南 郑州 450003)

HPLC同时测定加味逍遥丸中栀子苷和芍药苷的含量

杨庆胜1，2*，冯朝岭1，司根令2

(1.河南省医药药材有限公司，河南 郑州 450003；2.河南汉方药业有限责任公司，河南 郑州 450003)

目的：建立加味逍遥丸中栀子苷、芍药苷的含量测定方法。方法：高效液相色谱法，色谱柱为KromasilC18；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(15∶85)；检测波长为230 nm；进样量为10 μL；室温；流速为1.0 mL·min-1。结果：栀子苷在0.24～2.16 μg进样量与峰面积间呈良好的线性关系，r=0.999 6，平均回收率为99.29%；芍药苷在0.12～1.08 μg进样量与峰面积间呈良好的线性关系，r=0.999 7，平均回收率为99.62%。符合测定方法学研究的要求。结论：本方法操作方便，专属性强，重复性好，可作为该制剂的含量测定方法。

加味逍遥丸；栀子苷；芍药苷；高效液相色谱法；含量测定

加味逍遥丸是收载于《中国人民共和国药典》2010版一部的品种，处方由柴胡、当归、白芍、白术(麸炒)、茯苓、甘草、牡丹皮、栀子(姜炙)、薄荷九味中药组成，具有舒肝清热、健脾养血的功能，用于肝郁血虚、肝脾不和、两胁胀痛、头晕目眩、倦怠食少、月经不调、脐腹胀痛[1]。栀子苷、芍药苷分别为栀子、白芍的特征性有效成分，栀子苷、芍药苷是加味逍遥丸的活性成分之一。原质量标准只有芍药苷的含量测定，为了控制加味逍遥丸的质量，保证其疗效，在对该品种进行研究提高的过程中，采用高效液相色谱法，同一条件下测定栀子苷、芍药苷在该制剂中的含量，并对测定方法学进行研究。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

FA-2004型电子分析天平(上海上平仪器公司)；KG3200超声波振荡器(昆山市超声波仪器有限公司)；Agilent 1100型高效液相色谱仪、Agilent化学工作站(美国)。

1.2 试剂

栀子苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110749-201115，)；芍药苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110736-201035)；加味逍遥丸三批样品为项目研发时自制(批号分别为130619，130622，130625)；缺栀子、白芍、牡丹皮的阴性样品也为自制；乙腈为色谱纯(天津四友公司)，其它试剂均为分析纯，水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱为KromasilC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(15∶85)；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为230 nm；柱温为室温；进样量为10 μL。理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取栀子苷对照品30 mg、芍药苷对照品15 mg，同置于250 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得栀子苷质量浓度为120 μg·mL-1、芍药苷质量浓度为60 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取加味逍遥丸5 g，研细，混匀，取细粉约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，浸渍过夜，超声处理(功率为260 W，频率为40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液的制备

取缺白芍、牡丹皮、栀子的处方药材，按加味逍遥丸制备工艺制成缺白芍、牡丹皮、栀子的阴性样品，按2.3方法制备阴性样品溶液。

2.5 线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液2、6、10、14、18 μL，注入液相色谱仪，按2.1色谱条件进样分析，记录峰面积。以进样量(X)与对应的峰面积(Y)作回归处理，得到芍药苷回归方程为Y=1709.717X+27.910，r=0.999 7；栀子苷回归方程为Y=1646.308X+66.086，r=0.999 6。结果表明，芍药苷在0.12～1.08 μg、栀子苷在0.24～2.16 μg进样量与峰面积间均具有良好的线性关系。

2.6 专属性试验

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按2.1色谱条件进行测定，记录色谱图，从色谱图中可以看出，本测定条件的专属性强，阴性样品对芍药苷、栀子苷的含量测定无干扰。见图1～3。

图1 栀子苷、芍药苷对照品色谱图

图2 供试品色谱图

图3 阴性样品色谱图

2.7 精密度试验

精密吸取上述混合对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，重复进样6次，分别测定芍药苷、栀子苷的峰面积积分值，芍药苷RSD=1.16%(n=6)；栀子苷RSD=1.39%(n=6)。表明本法精密度较好，符合定量分析要求。

2.8 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液(批号：130622)，分别于0、2、4、6、8、10 h各进样10 μL，测定芍药苷、栀子苷的峰面积积分值，芍药苷RSD=1.28%(n=6)；栀子苷RSD=1.32%(n=6)。表明供试品溶液在10 h内基本稳定。

2.9 重复性试验

取同一批号供试品(批号：130622)，按2.3方法平行制备5份供试品溶液，各吸取10 μL，分别注入液相色谱仪，进行含量测定，栀子苷的平均质量分数为3.561 8 mg·g-1，RSD=1.42%；芍药苷的平均质量分数为2.281 2 mg·g-1，RSD=1.36%。表明本方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验

取已知含量的同一供试品(批号：130622)细粉6份，每份约5 g，研细，混匀，分别取细粉0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，每份分别精密加入混合对照品溶液稀释液50 mL(精密吸取上述对照品混合溶液20 mL，用甲醇稀释至50 mL，即得。稀释液中栀子苷质量浓度为48 μg·mL-1、芍药苷质量浓度为24 μg·mL-1)，余下按2.3方法操作，分别吸取供试品液各10 μL，按2.1色谱条件，分别测定栀子苷、芍药苷的含量，计算加样回收率，结果见表1、表2。

表1 栀子苷加样回收率试验

表2 芍药苷加样回收率试验

2.11 供试样品的含量测定

分别取不同批号的样品，按2.3方法制备。精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按2.1色谱条件分别测定各样品中栀子苷和芍药苷的含量，测定结果见表3。

表3 三批供试品中栀子苷和芍药苷的含量测定结果

注：加味逍遥丸规格为6 g/袋。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

文献资料[1]显示，栀子苷、芍药苷二者的检测波长非常接近，为了确保检测的灵敏度，本研究对栀子苷、芍药苷对照品溶液进行了紫外扫描分析，结果波长为230 nm，两者的检测灵敏度均较好，峰形好，峰面积变化较小，故本研究选择230 nm作为检测波长。

3.2 流动相的选择

本研究曾选用不同比例的乙腈-水[1]、乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液[2]、乙腈-0.1%磷酸溶液[3]、乙腈-0.1%醋酸溶液[4]、甲醇-0.2%磷酸溶液[5]等系统为流动相作了系统地比较，结果表明，以乙腈-0.1%磷酸溶液(15∶85)作为流动相时，栀子苷、芍药苷峰形较好，分离度也好。因此，选择乙腈-0.1%磷酸溶液(15∶85)作为流动相。

3.3 溶剂和超声时间的选择

本研究在供试品溶液的制备过程中，曾选用甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇四种溶剂分别超声处理20 min，结果四种溶剂所得供试液色谱基本一致，以甲醇为溶剂测定的含量最高。再以甲醇为溶剂分别超声处理20、30、40 min，结果超声处理30 min与超声处理40 min的供试液测定值高于超声处理20 min的测定值，但二者基本相同，故确定以甲醇超声处理30 min作为制备供试品溶液的条件。

3.4本研究按照测定方法学研究的要求，对加味逍遥丸中栀子苷、芍药苷的含量测定过程中的色谱条件、线性关系、专属性、精密度、稳定性、重复性、加样回收率等因素条件分别进行了考察，结果表明，本方法操作方便，线性关系良好，专属性强，稳定性、重现性好，加样回收率符合要求，可作为该制剂的含量测定方法。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部 [S].北京：中国医药科技出版社，2010：96-97，231-232，667-668.

[2] 王玉鹏，赵丽华，王杰松.高效液相色谱法测定调经活血片中芍药苷的含量[J].武警医学，2008，19(07)：617-618.

[3] 周卿，兑丹华，代广会，等.RP-HPLC法同时测定清胰汤颗粒中栀子苷、芍药苷的含量[J].重庆医科大学学报，2007，32(3)：268-270.

[4] 周瑾，庄惠清.HPLC法测定丹栀逍遥丸中栀子苷和芍药苷的含量[J].中国药事，2007，21(7)：495-497.

[5] 赵江红，董文玲，刘伏先，等.HPLC法测定降脂排毒片中栀子苷的含量[J].中医研究，2011，24(11)：26-28.

DeterminationofGeniposideandPaenoiflorininJiaweiXiaoyaoWanbyHPLC

YANG Qingsheng1，2*，FENGChaoling1，SIGenling2

(1.HenanPharmaceuticalMedicinesCo.，Ltd，Zhengzhou450003，China；2.HenanHanfangPharmaceuticalCo.，Ltd，Zhengzhou450003，China)

Objective：To establish a method for determination of geniposide and paenoiflorin in Jiawei Xiaoyao Wan.Methods：The separation was performed on Kromasil C18column at 25 ℃，using acetonitrile -0.1% phosphoric(15∶85)as a mobile phase，injecting amount 10μL，the flow rate was 1.0 mL·min-1，the UV detection wavelength was 230 nm.Results：Geniposide showed a good linear relationship in range of 0.24-2.16 μg，r=0.999 6，the average recovery was 99.29%.Paenoiflorin showed a good linear relationship in range of 0.12-1.08 μg，r=0.999 7，the average recovery was 99.62%.Conclusion：The method is sample，accurate and practical，and suitable for the determination of Jiawei Xiaoyao Wan.

Jiawei Xiaoyao Wan；geniposide；paenoiflorin；HPLC；determination

2014-04-10)

*

杨庆胜，男，副主任药师，研究方向：中药的成分分析与新产品开发； Tel：(0371)60986969，E-mail：yangqsheng@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.1.016