校正超滤法测定木香烃内酯和去氢木香内酯的大鼠血浆蛋白结合率

宁慧，莫微

(1.上海标杆经贸有限公司，上海 201612；2.泰州市海陵区预防保健办公室，江苏 泰州 225300)

·基础研究·

校正超滤法测定木香烃内酯和去氢木香内酯的大鼠血浆蛋白结合率

宁慧1，莫微2*

(1.上海标杆经贸有限公司，上海 201612；2.泰州市海陵区预防保健办公室，江苏 泰州 225300)

目的：同时测定木香烃内酯和去氢木香内酯的大鼠血浆蛋白结合率。方法：采用加标血浆样品测定超滤管对药物的非特异吸附系数，对超滤法进行校正，并用已知血浆蛋白结合率的药物紫杉醇验证、校正超滤法的准确性。结果：测得木香烃内酯大鼠血浆蛋白结合率为88.25%～92.14%，去氢木香内酯大鼠血浆蛋白结合率为85.34%～89.37%。结论：木香烃内酯的血浆蛋白结合率略高于去氢木香内酯，该校正超滤法可以广泛应用于药物的血浆蛋白结合率测定。

校正超滤法；木香烃内酯；去氢木香内酯；血浆蛋白结合率

木香烃内酯(Costunolide，Cos)和去氢木香内酯(Dehydrocostus lactone，Dehy)是木香中最主要的活性成分(化学结构见图1)，具有抗癌[1]、抗炎[2]、抗菌[3]、抗病毒[4]等药理活性，其研究开发价值重大。有研究表明[5]，Cos和Dehy具有协同作用效应，因此联合用药将是这两个化合物研发的一个重要方向。迄今，这两个化合物的血浆蛋白结合率的联合测定尚未见报道。

图1 Cos和Dehy的化学结构

药物血浆蛋白结合率是指药物与血浆蛋白结合的量占药物总量的百分比，其对药物代谢动力学和药效动力学有非常重要的影响，不仅影响药物在体内的作用强度和时间，而且常与药物的相互作用机制紧密相关，因此药物血浆蛋白结合率对于新药研究开发及指导临床合理用药具有重要意义[6]。目前，血浆蛋白结合率测定的方法有数种，以平衡透析法和超滤法最为普遍，其中平衡透析法因优点多而受到众多研究者的青睐[7]。本研究采用一种全新的策略，测定超滤膜对药物的非特异性吸附系数，以消除非特异性吸附对实验结果的干扰，并将该法应用于Cos和Dehy的大鼠血浆蛋白结合率的联合测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

LC-20A岛津高效液相色谱系统；配备紫外检测器(HPLC-UV)(Shimadzu，Japan)；超声波清洗器(AS2060，天津自动科学仪器设备有限公司)；漩涡混合器(XW-80A，上海青浦沪西仪器厂)；高速离心机(TGL-16gR，上海安亭科学仪器厂)；台式快速离心浓缩干燥器(LNG-T88，太仓市华美生化仪器厂)；超滤管(Microcon YM-10；MWCO 10 K，包含套管和膜管)，见图2。

Cos、Dehy和紫杉醇(PTX)(纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司)；Milli-Q纯水(Millipore，Bedford，MA，USA)；甲醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、二甲亚砜、三氟乙酸(TFA)(色谱纯，阿拉丁公司)；大鼠血浆来源于SPF级SD大鼠(上海西普尔必凯实验动物有限公司)。

图2 超滤管结构图

1.2 方法

1.2.1 大鼠血浆超滤液和截留液的制备 将12.0 mL的大鼠血浆分装至超滤管(0.4 mL/管)中，10 000 r离心10 min，收集超滤液约4 mL，截留液约8 mL。

1.2.2 标准曲线的制备 用超滤液对混合对照品溶液(DMSO配制，Cos、Dehy和PTX质量浓度均为1.0 mg·mL-1)进行梯度稀释，制备质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg·mL-1的混标溶液，以标准液浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归，制备Cos、Dehy和PTX的超滤液标准曲线。用截留液对混合对照品溶液(DMSO配制，Cos：1.0 mg·mL-1，Dehy：1.0 mg·mL-1，PTX：4.0 mg·mL-1)进行梯度稀释，制备质量浓度分别为2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg·mL-1的Cos、Dehy混标溶液，以及质量浓度分别为 10.0、20.0、40.0、100.0、200.0 μg·mL-1的PTX标准溶液。以标准液浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归，制备Cos、Dehy、PTX的截留液标准曲线。

1.2.3 样品前处理 超滤液直接采用HPLC-UV色谱系统进行分析。截留液的前处理方法参考文献[5]报道的方法。取50.0 μL血浆样品于1.5 mL离心管中，加入100.0 μL丙酮，涡旋30 s，然后加入400.0 μL乙酸乙酯，涡旋2 min，超声震荡3 min，-20 ℃静置10 min，10 000 r离心10 min，上清液转移至另一个1.5 mL离心管中，残渣用200.0 μL乙酸乙酯再提取1次；合并2次提取的上清液，用离心浓缩仪挥干，加入50.0 μL甲醇-水(7∶3，v/v)溶液，涡旋2 min，复溶，10 000 r离心10 min，取10.0 μL上清液于HPLC-UV色谱系统进行分析。1.2.4 色谱条件 ODS-100S C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温为35 ℃；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为220 nm；等度洗脱，流动相为水(含0.1%TFA)-乙腈(48∶52，v/v)；进样体积为10.0 μL。

1.2.5 超滤管对Cos、Dehy和PTX的非特异性吸附考察 将200 μL超滤液混标(Cos、Dehy和PTX质量浓度均为5.0 μg·mL-1)移入超滤管中，12 000 r离心3 min，取套管中的超滤液，采用HPLC-UV色谱系统进行分析，利用超滤液标准曲线方程计算套管中超滤液混标的浓度(C)。非特异性吸附率(NSB)的计算公式为(1)。

(1)

1.2.6 校正系数的推导及血浆蛋白结合率的计算 血浆中药物分子与血浆蛋白呈现动态结合，因此血浆中的药物总存在2种状态：游离态(f)和结合态(b)。笔者将含药血浆加入膜管中后，如果不存在超滤膜的非特异性吸附，其药物总量(T)的计算公式为(2)；如果存在超滤膜的非特异性吸附，其药物总量(T)的计算公式为(3)。

T=f1+b1

(2)

T=n+f2+b2

(3)

式中，f1：不存在非特异性吸附时游离态药物量；b1：不存在非特异性吸附时结合态药物量；n：非特异性吸附的药物量；f2：存在非特异性吸附时游离态药物量；b2：不存在非特异性吸附时结合态药物量。

滤膜对药物的非特异性吸附作用不会改变药物的血浆蛋白结合率，因此不管是否存在非特异性吸附，游离态药物量与结合态药物量的比值应是一个常数(k)，可由公式(4)计算。

(4)

在血浆体系中，药物的非特异性吸附率N可用公式(5)计算。

(5)

结合公式(2)、(3)和(5)，可推导出公式(6)；结合公式(4)和(6)，可推导出公式(7)。

(6)

(7)

含药血浆在超滤过程中，由于膜的非特异性吸附，会使游离的药物量b1降低成b2，它们之间存在公式(7)中变量关系。在体积一定的情况下，由于膜的非特异性吸附，会使含药血浆中游离的药物浓度c1降低成c2，它们之间存在公式(8)中的变量关系。

(8)

药物的血浆蛋白结合率(PPB)计算公式为(9)。

(9)

其中，ct：含药血浆中药物的总浓度；c1：无特异性吸附时游离药物的浓度。

在用超滤法测定药物的血浆蛋白结合率时，药物的非特异性吸附量n用公式(10)计算。

n=T-[(cu×vu)+(cd×vd)]

(10)

其中，cu：超滤后截留液中的药物浓度；vu：超滤后截留液的体积；cd：超滤液中的药物浓度；vd：超滤液的体积。

结合公式(5)和(10)，可得公式(11)。

(11)

由于参数cu、cd、vu和vd均可测得，而含药血浆中药物的总量T已知，因此根据公式(11)可计算出超滤膜对药物的非特异性吸附率N值。由于c2的浓度可以由超滤液中测得，因此将N值和c2值代入公式(8)中可计算出c1值。含药血浆中药物的总浓度ct值是已知的，因此将c2值和ct值带入公式(9)中可计算出校正后药物的血浆蛋白结合率。

1.2.7 Cos、Dehy和PTX的大鼠血浆蛋白结合率测定 用空白大鼠血浆对混合对照品溶液(DMSO配制，Cos：1.0 mg·mL-1，Dehy：2.0 mg·mL-1和PTX：4.0 mg·mL-1)进行梯度稀释，制备高浓度(Cos：20.0 μg·mL-1，Dehy：40.0 μg·mL-1，PTX：80.0 μg·mL-1)、中浓度(Cos：10.0 μg·mL-1，Dehy：20.0 μg·mL-1，PTX：40.0 μg·mL-1)和低浓度(Cos：4.0 μg·mL-1，Dehy：8.0 μg·mL-1，PTX：16.0 μg·mL-1)3个质量浓度水平的加标含药血浆。将超滤管的膜管和套管用精密天平分别称重，分别计为Wm0和Wt0。将200 μL的含药血浆装入超滤管中，37 ℃温育30 min，让药物分子与超滤膜和血浆蛋白的结合达到动态平衡，10 000 r离心10 min，准确称量膜管(含截留液)和套管(含超滤液)的重量，分别计为Wm1和Wt1。超滤液和截留液中药物浓度用1.2.3和1.2.4项的方法进行分析。

超滤液体积(vd)的计算公式为(12)；截留液体积(vu)的计算公式为(13)。

(12)

(13)

其中，1.002为大鼠血浆超滤液的密度(g·mL-1)；1.006为大鼠血浆截留液的密度(g·mL-1)。

将测得的cu、cd、vu和vd值及已知的血浆加标量T值代入公式(11)，即可计算出超滤膜对血浆中不同浓度水平药物的非特异性吸附率N值；最终根据1.2.6项的推导方法，可计算出校正后不同浓度水平药物的血浆蛋白结合率。

2 结果与分析

2.1 色谱图

Cos、Dehy和PTX含药血浆HPLC-UV图见图3。PTX、Cos和Dehy的保留时间分别为9.1、14.3、16.1 min。血浆内源性成分对分析物均无干扰，表明该分析方法的专一性满足这3种化合物的定量分析要求。

注：A.空白大鼠血浆超滤液；B.加标大鼠血浆超滤液；C.空白大鼠血浆截留液；D.加标大鼠血浆截留液。图3 Cos、Dehy和PTX含药血浆HPLC-UV图

2.2 线性回归方程

超滤液中Cos、Dehy和PTX在0.5～10.0 μg·mL-1，均具有良好的线性关系，线性回归方程分别为Cos：Y1=22 703X1+486，r=0.999 9；Dehy：Y2=16 876X2-1189，r=0.999 6；PTX：Y3=20 408X3+570，r=0.999 7。截留液中Cos和Dehy在2.5～50.0 μg·mL-1，也具有良好的线性关系，线性回归方程分别为Cos：Y4=18 268X4-9324，r=0.999 9；Dehy：Y5=7345X5-7536，r=0.999 8。截留液中PTX在10.0～200.0 μg·mL-1，具有良好的线性关系，线性回归方程分别为PTX：Y6=20 752X6+40 513，r=0.999 7。

2.3 超滤管对Cos、Dehy和PTX的非特异性吸附

用加标质量浓度均为5.0 μg·mL-1的Cos、Dehy和PTX混标超滤液，考察超滤管对3种药物的非特异性吸附作用。研究结果表明，超滤膜对Cos、Dehy和PTX均有很强的非特异性吸附作用，非特异性吸附率分别为60.7%、75.6%和84.8%。在超滤过程中，尽管超滤膜会吸附游离的药物分子，使其浓度下降，但结合在血浆蛋白上的药物分子也会动态解吸附，补充游离药物的浓度。因为超滤液中不存在与药物结合的血浆白蛋白，药物分子都是游离态的，超滤膜的非特异性吸附会使药物浓度急剧下降，从而使测得的非特异性吸附率(NSB)很大。用该NSB值作为校正系数，计算含药血浆中游离药物的浓度，会得到1个偏大值，最终会获得1个偏小的药物血浆蛋白结合率(PPB)。而且，用这种校正方法测量药物的血浆蛋白结合率时，药物的真实PPB越大，测得的PPB的准确性也越差，只有当药物的真实PPB非常小时，所测结果才可能接近准确。为克服这种PPB测定方法的局限性，笔者采用1.2.6项的校正方法来测定药物的PPB。

2.4 校正系数及药物血浆蛋白结合率的测定结果

用低、中、高3水平血浆药物浓度，按照1.2.6和1.2.7项的方法，测定不同浓度水平下的校正系数和药物血浆蛋白结合率，见表1。Cos的大鼠血浆蛋白结合率为88.25%～92.14%；Dehy的大鼠血浆蛋白结合率为85.34%～89.37%；PTX的大鼠血浆蛋白结合率为93.16%～94.56%。PTX是一种已上市的抗癌药物，其血浆蛋白结合率的研究报道较多，不同的测定方法测定PTX的血浆蛋白结合率的范围为89%～98%[8]，与本实验结果相符，从而也验证了该校正方法的准确性。本研究结果表明，Cos和Dehy均为高血浆蛋白结合率的药物，且Cos的大鼠血浆蛋白结合率略高于Dehy。

表1 校正系数及药物血浆蛋白结合率的测定结果

3 结论与讨论

目前血浆蛋白结合率测定的方法有：平衡透析法[9-10]、超滤法[11-12]、微透析法[13-14]、高效亲和色谱法[15-16]和高效前沿分析法[17]，其中以平衡透析法和超滤法最为普遍。平衡透析法结果较为可靠，但操作繁复，耗时长；超滤法由于利用离心力迫使游离药物通过半透膜而大大加速了实验过程，缩短了实验时间。其简便、快捷的优点受到众多研究者的青睐[7]。然而，由于超滤膜对许多药物存在非特异性吸附，从而会影响血浆蛋白结合率的测定结果，在一定程度上限制了该方法的使用范围。尽管许多研究者在减小非特异性吸附方面做了大量工作，但这种非特异性吸附作用仍无法完全消除[18-19]。

Lee等[20]采用磷酸盐缓冲液(PBS)作为空白对照，测定超滤膜对药物的非特异吸附系数，然后对超滤法进行校正，从而测定药物的血浆蛋白结合率，但由于PBS与血浆体系之间差异很大，导致非特异吸附系数测定不准确。廖凯谊等[7]采用血浆超滤液作为对照，测定超滤膜对药物的非特异吸附系数，然后对超滤法进行校正，以测定药物的血浆蛋白结合率。此方法较适用于血浆蛋白结合率非常低的药物，对高血浆蛋白结合率的药物并不适用。低血浆蛋白结合率的药物绝大部分药物分子呈游离状态，这种体系与血浆超滤液体系非常相似，因此可以用超滤液作为对照，测定超滤膜对药物的非特异性吸附系数。如果药物的血浆蛋白结合率很高，则血浆体系中游离的药物分子就非常少，绝大部分药物分子与血浆蛋白动态结合，形成药物分子的储存库。在超滤过程中，尽管超滤膜会吸附游离的药物分子，使其浓度下降，但结合在血浆蛋白上的药物分子也会动态解吸附，成为游离的药物分子，从而使游离药物浓度得到部分补充，此动态解吸附—补充的过程是使用血浆超滤液作对照时无法模拟的。因此，采用血浆超滤液作为对照，对超滤法进行校正也存在一定的局限性。本研究采用一种全新的策略，测定超滤膜对药物的非特异性吸附系数，以消除非特异性吸附对实验结果造成的干扰，并将该法应用于Cos和Dehy的大鼠血浆蛋白结合率的联合测定。由于本实验测定的校正系数是在真实的血浆体系下测定，比在PBS体系或超滤液体系中测定的更准确，因此可以广泛应用于药物血浆蛋白结合率的测定。

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DeterminationofRatPlasmaProteinBindingRateofCostunolideandDehydrocostusLactonebyRectifiedUltrafiltration

NINGHui1，MOWei2*

(1.ShanghaiBiaoganTradeCo.Ltd，Shanghai201612，China；2.HaiLingpreventiveandhealthcareoffice,Taizhou225300,China)

Objective：To determinate costunolide and dehydrocostus lactone plasma protein binding rate in rat plasma.Methods：The spiked plasma was used to determine nonspecific binding coefficient of drugs with the ultrafiltration device，and then the nonspecific binding coefficients were used for rectifying the determination results of plasma protein binding rates of drugs.The accuracy of this method was validated by known plasma protein binding rates of paclitaxel.Result：The rat plasma protein binding rate of costunolide and dehydrocostus lactone were 88.25%-92.14% and 85.34%-89.37%，respectively.Conclusion：The rat plasma protein binding rate of costunolide is slightly higher than that of dehydrocostus lactone，and this rectified ultrafiltration can be widely used for determining plasma protein binding rate of drugs.

Rectified ultrafiltration；costunolide；dehydrocostus lactone；plasma protein binding rate

2014-09-29)

*

莫微，副主任医师，研究方向：社区预防保健；Tel：(0523)86223131，E-mail：tzmw@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.4.006