响应面法优化人参花多糖的提取工艺

万茜淋，焦丽丽，马林，王明珠，刘淑莹，2

（1.长春中医药大学　吉林省人参科学研究院，长春　130117；2.中国科学院长春应用化学研究所，长春　130022）

响应面法优化人参花多糖的提取工艺

万茜淋1，焦丽丽1，马林1，王明珠1，刘淑莹1，2

（1.长春中医药大学吉林省人参科学研究院，长春130117；2.中国科学院长春应用化学研究所，长春130022）

以人参花为原料，在单因素试验的基础上，采用响应面法，利用中心组合试验设计原理，对人参花多糖提取工艺中的各影响因素进行优化。以提取时间、液料比、提取次数和提取温度为试验因素，人参花多糖提取率为响应值，进行四因素五水平试验建立模型，获得多元二次回归方程。结果表明：提取时间2.495h，液料比38.55∶1（g/g），提取次数5次，提取温度80℃时，人参花多糖提取率预测值为13.94%。最佳条件下人参花多糖提取率为13.81±0.28%，表明实测值与理论值之间具有良好的拟合度，回归模型切实可行，优化的工艺条件可用于人参花多糖提取。

人参；多糖；提取；响应面分析法

人参（Panax Ginseng C.A.Meyer），刺五加科植物，在中国、韩国和日本等传统医学中广泛使用，具有补气生津，镇静等功效。人参中富含多种活性成分，包括人参皂苷、人参多肽、人参多糖等。中外学者对人参中上述成分的功能特性和药用价值已进行广泛而深入的研究［1，2］。近年来研究发现，人参多糖不仅具有免疫调节作用，同时具有抗肿瘤、抗氧化、抗辐射、抗黏连以及降糖等活性［3-7］。Shin等人研究发现，人参叶和人参果可能具有与人参根相似的药理活性，从而在临床上得到应用［8］。然而，目前关于人参花的研究少之甚少，特别是对人参花的多糖研究尚未见报道。

响应面法（Response Surface Methodology，RSM）是一种应用广泛的试验优化方法，它能够有效快速地确定多因子系统的最佳条件，已应用于多种优化试验中［9，10］。响应面法通过建立回归分析模型，缩短试验前期条件摸索的时间。因此，本研究采用响应面法，通过中心组合试验设计（CentralComposite Design，CCD）原理，优化人参花多糖（Ginseng Flower Polysaccharides，GFP）的提取条件，提高GFP的提取率，为人参花多糖的深入研究和开发利用奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

人参花采集于中国吉林省抚松县人参种植基地，经长春中医药大学王淑敏教授鉴定为为五加科植物人参Panax ginseng的干燥花蕾。单糖标准试剂购于Sigma化工有限公司（St.Louis，MO，USA）。

试验中所有化学试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

台式高速离心机（Eppendorf公司）；恒温水浴锅（北京医疗设备厂）；AB 135-S电子分析天平（METTLER TOLEDD公司）；粉碎机（欧凯莱芙宝业公司）；KQ-500DA型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

1.3方法

1.3.1多糖提取工艺流程

人参花粉碎→95%乙醇回流→离心→沉淀干燥→水提→醇沉→沉淀复溶→冻干→计算多糖提取率。

1.3.2多糖提取率计算

GFP提取率计算公式如下：

其中，m0（g）表示干燥GFP重量，m（g）表示干燥原料重量。

1.3.3单因素试验设计

分别对不同的提取温度（40、50、60、70、80、90、100℃）、液料比（10、15、20、25、30、35、40、45，g/g）、提取时间（0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5h）和提取次数（1、2、3、4、5、6、7次）进行单因素试验，考察各单因素对GFP提取率的影响。

1.3.4响应面法试验设计

通过单因素试验确定的四个独立变量范围后，采用CCD设计法提供的方案进行试验（分别标记为：X1，提取时间；X2，液料比；X3，提取次数；X4，提取温度）［11］。根据CCD设计原理，选取对试验结果有显著影响的因素及其范围，设计四因素五水平的响应面试验方案，如表1所示，从而获得最佳条件组合。

表1　Central composite试验设计因素水平

CCD试验按照以下方程设计：

其中，Xi表示独立变量的编码值，也是实际变量的值。X0表示独立变量中心点的值。ΔXi是独立变量的差值。

设计的31组试验方案以随机次序进行，如表2所示，每组试验进行3次平行操作，计算得到平均响应值，通过程序分析，得出响应面分析图、拟合方程以及方差分析表，通过Design-Expert 8.0.5b软件中的程序对试验结果进行响应面分析，经二次回归拟合后，求得响应函数如公式（3）得出回归方程：

其中，Yk代表响应函数（GFP提取率），βk0表示截距，βki，βkii和βkij分别代表线性系数，二次系数，交叉系数。xi和xj代表独立变量。

2　结果与讨论

2.1单因素试验结果

2.1.1提取温度对GFP提取率的影响

在提取时间2h，液料比35（g/g），提取次数4次的条件考察不同提取温度对GFP提取率的影响。结果如图1（a）所示：提取温度从40℃升高到80℃时，GFP提取率从8.1%增加到9.2%。提取温度持续升高到100℃时，GFP提取率依然增加，但是随着提取温度的升高，会对GFP化学结构产生影响，工业化生产过程中也会增加成本。因此，最佳提取温度范围确定为50～90℃。

2.1.2提取时间对GFP提取率的影响

在提取温度70℃，液料比35（g/g），提取次数4次的条件考察不同提取时间对GFP提取率的影响。结果如图1（b）所示：随着提取时间从0.5h增加到2h，GFP提取率明显增加，提取时间2h时，提取率最大，为9.2%，但是超过2h后，GFP提取率下降。因此，最适宜的提取时间范围确定为1～3h之间。

2.1.3液料比对GFP提取率的影响

在提取温度70℃，提取时间2h，提取次数4次条件下考察不同液料比，对GFP提取率的影响。结果如图1（c）所示：液料比从10到45（g/g），GFP提取率从6.98%增加到14.68%。因此，最佳液料比范围确定在25～45（g/g）。

2.1.4提取次数对GFP提取率的影响

在提取温度70℃，提取时间2h，液料比35（g/g）条件下考察提取次数对GFP提取率的影响。结果如图1（d）所示：GFP提取率随着提取次数的增加持续升高，从5.89%升高到13.29%。为节约成本，最佳提取次数范围选定在2～6次。

根据上述单因素试验研究结果，响应面法优化试验提取参数范围如下：提取温度50～90℃；提取时间1～3h；液料比25～45（g/g）；提取次数2～6次（见表1）。

图1　提取温度

2.2响应面法优化GFP提取工艺

2.2.1Central composite试验设计及结果

与传统的单因素优化方法相比，RSM法具有节省时间、空间和原材料的优势［12］。根据单因素试验结果，利用CCD法，为GFP提取设计31组优化方案。各组试验响应值（GFP提取率，Y，%）如表2所示，GFP提取率在9.48%～14.78%之间。

2.2.2模型建立及拟合模型

CCD设计方案与响应值结果如表2所示。利用Design-Expert 8.0.5b软件对表2中数据进行多项式回归分析、F检验和方差分析，结果如表3所示。

同时，对试验参数及结果进行回归拟合，得到GFP提取率与各因素变量间的多项式方程如下（R2=0.93）：

表2　中心组合试验设计方案与GFP响应值

模型拟合方面，方程F值为14.91，P＜0.0001，说明使用上述回归方程描述提取参数与响应值之间的关系时，能够正确反映因变量与自变量之间的关系，模型高度显著，证实该试验方法的可靠性和准确性；此模型决定系数R2=0.9288，表明回归方程拟合较好；失拟项P＜0.0001，说明由噪音引起模型偏差的概率小于0.01%；模型校正决定系数Radj2=0.8665，表明本实验86.65%的数据变异可以用此回归方程解释，能够较好地确定关键影响因素；离散系数（C. V.%=3.44%）表示试验的精确度，离散系数越低，说明试验数值有较高的精度和可靠性［13］。综上所述，该模型能够用于表示提取参数和GFP提取率的关系，具有较高应用价值。

表3　中心组合试验设计试验结果方差分析及显著性检验

P值用于衡量回归方程中每个系数的准确性，进而了解独立变量之间的交互作用影响。P＜0.05表明该系数是非常有意义的［14］。由回归方程系数显著性检验可知，表3的线性系数（X1，X2，X3，X4）中，X2、X3、X4影响极显著（P＜0.01），X1影响显著（P＜0.05）；二次项系数（X12，X22，X32，X42）中，X12，X32影响极显著（P＜0.01），X42影响显著（P＜0.05）；交叉乘积系数（X1X2，X1X3，X1X4，X2X3，X2X4，X3X4）中，仅有X1X2影响显著（P＜0.05）。综上所述，各试验因素对响应值并不是简单的线性关系，二次项对响应值的影响也有很大的关系，交互作用的影响相对较小。此外，其他的显著性差异都大于0.05，说明影响不是很明显。因此，X1、X2、X3、X4、X12、X32、X42和X1X2表示的参数都是GFP提取过程中重要的因素。针对4个提取参数的研究中，各因素对响应值的影响排序为：提取温度＞提取次数＞液料比＞提取时间。

2.2.3响应面图及等值线图分析

RSM方法的数据图形是根据特定的响应值Y与各因素X1，X2，X3，X4之间构成的二维和三维图像，响应图中曲线越陡峭，则表明相对应因素对响应值的影响越大，响应值变化越大。三维响应面图能够直观反映出各因素对GFP提取率的影响以及各因素之间的相互作用。响应图中等高线形状也能够直观反映出两因素之间交互作用大小，等高线呈现椭圆形体现两因素交互效应显著，而圆形则说明因素间交互作用较弱。回归方程的2D等值线图和3D响应面图见图2和图3。2D等高线图和3D响应面图整体趋势一致。

图2　提取时间（X1），液料比（X2），提取次数（X3）及提取温度（X4）对GFP提取率的3D响应面图

为了研究可变参数之间的关系，每图表示两个变量，其他两个参数保持在一定水平（0水平，参见表1）。液料比和提取时间不同的情况下，3D响应面图和2D等值线图如图2（a）和3（a）所示，结果表明：提取时间对GFP提取率影响较小，当提取时间较短时，液料比和提取时间出现了交互作用，对提取率的影响较明显；图2（b）和3（b）表示提取时间和提取次数交互作用，当提取次数固定在某一水平时，随着时间的延长GFP提取率增加，随后呈下降趋势；由图2 （c）和3（c）可以看出，当提取时间从1h增加到2.5h时，提取温度对GFP提取率有非常积极的影响，超过2.5h以后，多糖的提取率逐渐下降；如图2（d）和3 （d）所示，当提取次数为5时，液料比的积极作用十分明显，即GFP提取率随着液料比的增加而增加，但超过5次后GFP提取率呈下降趋势；根据图2（e）和3（e）得知，GFP提取率随着液料比和提取温度的增加而升高，结果与前期单因素试验的结果相一致；图2f与3f体现了提取温度和提取次数对GFP提取率的交互影响，提取次数小于5时，随着提取温度的增加，多糖提取率明显增加，但是超过5次时，GFP提取率开始下降。因此，GFP最高提取率是当提取温度和提取次数分别为80℃和5次的条件下出现的。

根据分析结果，回归模型预测的GFP提取最佳工艺条件为：提取时间2.495h，液料比38.55（g/g），提取次数5次，提取温度80℃。在此条件下，GFP提取率理论值可达13.94%。

图3　提取时间（X1），液料比（X2），提取次数（X3）及提取温度（X4）对GFP提取率的2D等值线图

2.2.4提取工艺优化及预测模型验证

为了验证模型预测理论值的准确性和真实性，我们根据模型预测的优化条件进行3次平行试验，结果GFP提取率平均值为13.81±0.28%，与模型预测理论值13.94%相近，说明响应面优化的条件是合理有效的，具有极强的应用价值和指导意义。

3　结论

本研究以单因素试验方法作为基础，确定主要影响人参花多糖提取产量的因素及范围，结合CCD设计，确定最佳响应面区域，优化人参花中多糖提取的工艺条件，优化参数为：提取时间2.495h，液料比38.55（g/g），提取次数5次，提取温度80℃。上述条件下，GFP提取率为13.81±0.28%，与理论值13.94%相近，说明该模型比较可靠。

热水浸提法是一种从植物中提取多糖的传统方法。将RSM应用于人参花多糖的提取过程中，通过建立数据模型的方法，解决受多因素的影响的最优组合问题，提高人参花多糖的提取率。与传统的单因素试验相比，该方法不仅能够节约条件摸索的时间，降低提取成本，同时能够达到最高的提取率，是研究多因素试验有力的工具，该方法在人参花多糖提取中的应用，不仅为人参花多糖的提取奠定了理论基础，并为人参花多糖的实际工业提取提供理论依据。

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Optimization of Polysaccharides from Flowers of Panax Ginseng C.A.Meyer Using Response Surface Methodology

WAN Xilin1，JIAO Lili1，MA Lin1，WANG Mingzhu1，LIU Shuying1，2
（1.Jilin Ginseng Academy，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117；2.Changchun Institute of Applied Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Changchun 130022）

In this study，response surface methodology based on central composite design（CCD）was adopted to optimize the extraction conditions of polysaccharides from the flower of Panax ginseng C.A.Meyer（GFP）.The effects of four parameters，including extraction time（h），ratio of water to raw material，number of extraction and extraction temperature（°C）were investigated by single factor experiments，yield of the polysaccharides as the response values，the experimental data were fitted to a second-order polynomial equation.The optimum extraction conditions were determined as follow：extraction time 2.495 h，ratio of water to raw material 38.55∶1（g/g），and number of extraction 5，extraction temperature 80°C.Under these conditions，the experimental yield was 13.81±0.28%，which was well matched with the predictive yield of 13.94%.The model was significant that can be used for the extraction of GFP.

panax ginseng C.A.meyer；polysaccharides；extraction；response surface methodology（RSM）

Q539

A

1672-9870（2015）06-0154-05

2015-10-21

国家自然科学基金面上项目（02090106）；吉林省科技发展计划项目（20130206059YY）

万茜淋（1987-），女，硕士，助理实验师，E-mail：wanxilin1987@163.com

刘淑莹（1943-），博士，研究员，E-mail：syliu@ciac.ac.cn