秦巴山区虎杖内生放线菌的分离及鉴定

程贤利等

摘要：采用平板划线法从秦巴山区虎杖根状茎中分离内生放线菌，依照形态学常规分类方法和16S rDNA序列分析法进行鉴定，并以大肠埃希杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）为靶标菌，采用滤纸片扩散法研究虎杖内生放线菌发酵产物的抗菌活性。结果表明，分离得到的16株放线菌中，菌株PEA005和PEA006分属于拟诺卡菌属（Nocardiopsis）和小单孢菌属（Micromonospora），对枯草芽孢杆菌的抑菌圈达到21～28 mm，对金黄色葡萄球菌的抑制圈达到13～20 mm，而对大肠杆菌和铜绿假单胞菌抑制作用不显著。

关键词：虎杖；内生放线菌；分离；鉴定；秦巴山区；拟诺卡菌属；小单孢菌属

中图分类号： S567.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0392-03

通信作者：陈文强，教授，主要从事微生物资源研究开发与利用。E-mail：wenqiangc@126.com。虎杖（Polygonum cuspidatum）为蓼科植物，主要分布在我国湖北、四川、陕西等20多个省份，其根茎味微苦、微寒，归肝、胆、肺经，具活血散瘀定痛、清热解毒利湿、化痰止咳通喘之功效[1-2]。虎杖提取物中的有效成分是芪类和蒽醌类化合物，其中，芪类化合物包括白藜芦醇及白藜芦醇苷[3]。据报道，白藜芦醇具有抑制肿瘤、抗氧化、抗血栓及防治冠心病等作用[4-6]，被列为抗心血管疾病、抗癌最有前途的药物之一。

植物内生菌是指存活于健康植物组织内部、不引发宿主植物表现出明显感染症状的微生物类群，主要包括真菌、细菌和放线菌[7-8]，分布于植物根、茎、叶、花、果实和种子等器官组织的细胞或细胞间隙中[9]。植物与内生菌在长期协同进化中建立起独特的遗传与代谢关系，由于植物与内生菌相互间的基因交换，使得内生菌具有产生某些与植物相同或相似化合物的能力。目前发现并具有抗菌活性的代谢产物大多数来源于放线菌[10-11]，其种类多样性和丰富的代谢产物可以产生重要的生理活性物质，因此，从传统药用植物内生放线菌的次生代谢产物中，筛选出具有药用价值的活性物质或新型化合物，对新型药物开发及濒危植物资源保护具有重要意义[12]。

目前，国内外对虎杖资源的研究主要集中在虎杖内生真菌方面[13-15]，对内生放线菌的研究却鲜有报道。本试验以秦巴山区珍稀药用植物虎杖为材料，对其内生放线菌进行分离鉴定，并对内生放线菌次生代谢产物的抗菌活性进行初步研究，旨在为虎杖内生放线菌资源的开发和利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试材料虎杖采自陕西留坝县火烧店乡和陕西汉台区黄花河景区。靶标菌株：大肠埃希杆菌（Escherichia coli，ATCC8739）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，ATCC6633）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC6538）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC9027），均由陕西省食药用菌工程技术研究中心提供。

1.1.2培养基改良高氏Ⅰ号培养基：可溶性淀粉20.0 g、KNO3 1.0 g、NaCl 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、琼脂15.0 g、H2O 1 000.0 mL，pH值为7.2～7.4；改良高氏Ⅱ号培养基：葡萄糖1.0 g、蛋白胨0.5 g、胰蛋白胨0.3 g、NaCl 0.5 g、复合维生素0.5 g、琼脂15.0 g、H2O 1 000.0 mL，pH值为7.2～7.4；1/10 ATCC172合成培养基：葡萄糖1.0 g、可溶性淀粉2.0 g、酵母浸汁0.5 g、CaCO3 1.5 g、N-Z-Amine A 0.5 g、琼脂15.0 g、H2O 1 000.0 mL，pH 值为7.2～7.4；酵母膏-麦芽汁琼脂培养基（YE）：酵母粉4.0 g、麦芽汁提物6.0 g、葡萄糖4.0 g、复合维生素 3.75 mg、琼脂20.0 g，H2O 1 000 mL，pH 值为7.2；液体酵母膏―麦芽汁琼脂培养基，YE中不含琼脂。

1.1.3主要仪器设备LS-B50L高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；ZHWY-2102C数显式恒温摇床，上海志成有限公司；Mycycler PCR扩增仪、Gel Doc凝胶成像系统，美国Bio-rad公司；Allegra6低温高速离心机，美国Beckman公司。

1.2方法

1.2.1样品预处理将新鲜虎杖根表面泥沙清除，裁成合适大小，置于500 mL烧杯内，流水冲洗2 h；2% Tween-80溶液清洗表面，无菌环境下依次用75%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗；加含有1% Tween-80的0.1% HgCl2溶液分别浸泡0、35、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 min；无菌水冲洗5次，用手术刀取其韧皮部，研钵中研磨至匀浆，按1 ∶50比例加入无菌水，制备成匀浆液。

1.2.2菌株分离分别在改良高氏Ⅰ号培养基、改良高氏Ⅱ号培养基、1/10 ATCC172合成培养基中加入表1中的抑菌剂制成平板，吸取100 μL匀浆液，涂布，重复5次；取最后1次冲洗用的无菌水100 μL，涂布于各分离纯化培养基平板作为空白对照，以检测表面消毒情况。将平板倒置，28 ℃培养，随时观察平板菌落状态；将放线菌菌落挑在酵母膏-麦芽汁琼脂培养基上，采用平板划线法纯化至单个菌落。

表1在分离培养基中加入的选择性抑制剂及作用

名称浓度（mg/L）作用重铬酸钾K2Cr2O775.0抑制真菌和细菌制霉菌素nystatin75.0抑制霉菌萘啶酮酸nalidixic acid20.0抑制细菌

1.2.3抑菌试验分别将16株内生放线菌于28 ℃、160 r/min 发酵7 d；将发酵液12 000 r/min离心15 min，取上清，0.22 μm微孔滤膜过滤；滤液4 ℃冰箱保存，备用。挑取少量活化24 h的供试菌，在装有10.0 mL无菌水的试管中反复摇匀，制成菌悬液；用微量取液器分别取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌悬液各0.2 mL注入牛肉膏蛋白胨培养基平板表面，涂布均匀；将直径为 8.0 mm 的无菌滤纸片在发酵液中浸泡1 h，贴到培养基表面，每平板贴4片，其中每2片代表1种株菌，每处理做5个平板；将平板倒置，（36±1） ℃培养24 h，测量抑菌圈直径。

1.2.4菌株鉴定

1.2.4.1形态学鉴定观察记录分离菌株的菌落形态，菌丝体生长状态及可溶性色素的产生情况，依据阮继生等方法[16]进行初步鉴定。

1.2.4.2分子生物学鉴定采用CTAB法提取菌株DNA，利用PCR引物799F和1492R对菌株16S rRNA 基因进行扩增。PCR反应体系（25.0 μL）：2×Taq PCR Mix 12.0 μL、10.0 μmol/mL 引物各1.0 μL、D260 nm/D280 nm约等于1.80 的DNA模板2.0 μL、灭菌双蒸水9.0 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min、56 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，将纯化的PCR产物交上海生工生物科技有限公司进行双向测序；将所测序列提交GenBank数据库进行Blast检索；下载与分离菌株具有较高同源性的模式菌株数据，利用Clusta-X和Mega 5.1软件对所得序列进行人工校正及比对分析，按聚类分析法构建系统发育树。

2结果与分析

2.1虎杖不同消毒时间效果比较

使用含有1% Tween-80的0.1% HgCl2溶液，分别浸泡虎杖样品0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 min进行表面消毒，观察培养基上杂菌菌落的生长情况以考察消毒效果。结果表明，不使用HgCl2对虎杖样品进行表面消毒的对照组，即消毒0 min，培养基上的杂菌菌落很多，无法进行统计；随着HgCl2消毒时间的延长，菌落数逐渐减少，消毒3.5 min，菌落数在10个以上；消毒4.0 min，菌落数为5～10个；消毒4.5 min，菌落数少于5个；消毒时间超过5 min时，无菌落生长，但是，消毒时间过长，可能会导致内生菌被杀死。因此，虎杖样品表面消毒最佳时间为5 min。

2.2分离出的虎杖内生放线菌菌株形态

本试验共分离纯化出虎杖内生放线菌菌株16株，图1至图4为部分菌株的菌落形态。由图1至图4、表2可见，菌株PEA005表面干燥无突起，菌落较小，边缘规则，近似圆形，呈墨蓝色，产生可溶性色素；菌株PEA006表面有突起，湿润油状，菌落较细小，不规则小圆形，呈橙黄色，不产生可溶性色素；菌株PEA014表面无突起，干粉状，菌落较细小，较规则的圆形，边缘无晕圈，呈灰白色，不产生可溶性色素；菌株PEA023表面有小的突起，褶皱状，菌落较小，较规则圆形；呈褐色，产生的可溶性色素为酱红色。

2.3虎杖内生放线菌的抑菌活性

采用滤纸片法对内生放线菌发酵液进行抑菌活性试验，结果由表3可见，菌株PEA005和PEA006对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌抑菌效果显著，而对大肠杆菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌抑菌作用不显著。

2.4抑菌菌株的分子生物学鉴定

对2株具有较强抑菌作用的菌株PEA005、PEA006进行液体发酵培养，利用SDS-溶菌酶法提取菌株总DNA，并使用引物799F和1492R对16S rDNA进行PCR扩增，经上海生工生物科技有限公司进行双向测序，采用Mega5.5软件，按表2虎杖内生放线菌菌株的形态学特征

3结论与讨论

相关研究表明，较容易分离得到的植物内生菌是细菌和真菌，由于放线菌生长十分缓慢，且易被外源菌污染，许多放线菌特别是稀有放线菌未被发现[17-18]。选择性分离是虎杖内生放线菌分离的难点。

近年来，人们开展了大量有关植物内生放线菌的研究，并从药用植物虎杖中分离出许多新的放线菌。孔亚男等采用涂布法从虎杖组织中分离出47株内生放线菌，其中17株菌株对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌具有不同程度的抗菌活性，占所有分离菌株的36.2%，其中6株具有较明显的抑菌活性[19]。陈文强等对分离获得的41株内生放线菌进行抑菌试验时发现，有13株菌株至少对 1种靶标菌表现出不同的抑菌活性，其中2株菌株发酵液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢菌、大肠杆菌、沙门氏菌等4种靶标菌表现出不同程度的抑菌活性，显示了广谱的抗菌活性，可能具有很好的生物防治潜力[20]。

本研究采用平板划线法从秦巴山区药用植物虎杖根茎中分离得到16株内生放线菌，对其进行抗菌试验结果表明，菌株PEA005和PEA006对枯草芽孢杆菌的抑菌圈达到21～28 mm，对金黄色葡萄球菌的抑制圈达到13～20 mm，而对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抑制作用不显著。经鉴定，菌株PEA005和PEA006分属于拟诺卡菌属（Nocardiopsis）和小单孢菌属（Micromonospora）。

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