心肌缺血型冠心病肾虚血瘀病证结合模型研究

周晟芳等

摘要：目的 探討手术方法建立心肌缺血型冠心病与肾虚血瘀病证结合模型的可行性。方法 采取惊吓、置于寒冷环境并皮下注射氢化可的松的方法制备非疾病肾虚血瘀证候模型，结扎冠状动脉前降支并注射氢化可的松建立心肌缺血型冠心病肾虚血瘀病证结合模型。实验大鼠分为肾虚血瘀组、病证结合组和正常组，每组5只。观察大鼠造模前后体温、体质量、呼吸频率、心率、全血黏度、卡松黏度。依据中医临床肾虚血瘀证诊断标准，对2种模型中医证候进行比较。结果 与正常组和本组造模前比较，肾虚血瘀组、病证结合组大鼠造模后均出现体温下降、呼吸频率增快（P<0.05）；与正常组比较，病证结合组、肾虚血瘀组体质量减轻或者增长缓慢、全血黏度及卡松黏度升高（P<0.05，P<0.01）；造模两组间全血黏度、心电图比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论 2种模型在中医证候方面无明显差异，符合中医临床肾虚血瘀证的诊断标准。

关键词：心肌缺血型冠心病；动物模型；肾虚血瘀；病证结合；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.016

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）09-0056-04

Research on the Model of Combining Myocardial Ischemic Coronary Disease with Syndrome of Kidney Deficiency and Blood Stasis ZHOU Sheng-fang， LIU Ru-xiu， YIN Lin-lin， LUO He-wei， LI Hui， GUAN Xuan-ke （Guanganmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China）

Abstract：Objective To discuss the feasibility of establishing the model of combining myocardial ischemic coronary disease with syndrome of kidney deficiency and blood stasis by surgical method. Methods Non-disease of kidney deficiency and blood stasis syndrome model was built by taking the methods of fright， being placed in a cold environment and injection of hydrocortisone. The model of combining the myocardial ischemic coronary disease with the syndrome of kidney deficiency and blood stasis was established through ligating the left anterior descending branch of artery and injecting hydrocortisone. The rats were divided into kidney deficiency and blood stasis group， combination of disease and syndrome group， and normal group， 5 rats in each group. The temperature， weight， heart rate， breathing rate and whole blood viscosity， casson viscosity of the rats in the two groups before and after modeling were observed. According to TCM clinical diagnosis criteria of kidney deficiency and blood stasis syndrome， TCM syndrome characteristics of the two groups were compared. Results Compared with normal groups and before modeling， rat temperature dropped and breathing rate increased in kidney deficiency and blood stasis group， combination of disease and syndrome group （P<0.05）. Compared with normal group， rat weight decreased or grew slowly， and whole blood viscosity and casson viscosity increased （P<0.05， P<0.01）. There were statistical significant differences in whole blood viscosity and electrocardiogram between the two groups （P<0.05）. Conclusion There is no obvious difference between TCM syndrome characteristics of the two groups. They all meet the TCM clinical diagnosis criteria of kidney deficiency and blood stasis syndrome.

Key words：myocardial ischemic coronary disease；animal model；kidney deficiency and blood stasis；combination of disease and syndrome；rats

基金项目：国家科技支撑计划（2007BAI10B01-093）；北京市自然科学基金（7122153）；北京中医药“薪火传承3+3工程”（830104）

通讯作者：刘如秀，E-mail：Liuruxiu1@163.com

病证结合研究是中西医结合医学理论基础，建立动物病证结合模型是中医药现代研究取得突破性进展的关键。目前，中医药对心肌缺血型冠心病的实验研究大多局限于建立疾病模型，而忽视了动物模型的中医证候表现，难以全方位体现中医药治疗心肌缺血型冠心病的机制及特点。本研究通过手术方法建立心肌缺血型冠心病肾虚血瘀病证结合模型，并与非疾病肾虚血瘀证候模型相对照，通过比较其中医证候特点，探讨手术方法建立心肌缺血型冠心病肾虚血瘀病证结合模型的可行性。

1 实验材料

1.1 动物

2月龄Wistar大鼠15只，清洁级，体质量（250±20）g，雌雄不拘，本院实验动物中心提供，合格证号SCXK（京）2012-0001。分笼饲养于本院SPFⅡ级动物房，温度（20±2）℃，相对湿度45%～70%。

1.2 药物

盐酸利多卡因注射液，北京益民药业有限公司，批号20130120；氢化可的松注射液，天津金耀氨基酸有限公司，批号1303021；注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司，批号F3071110。

1.3 主要试剂与仪器

戊巴比妥钠，上海艾研生物有限公司，批号081130251。RM6240C多道生理信号采集处理系统（成都仪器厂），HX-300动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司），SA-6000全自动血流变测试仪（北京赛科希德科技发展有限公司）。

2 实验方法

2.1 分组

实验大鼠随机分为正常组、非疾病肾虚血瘀证候模型组（肾虚血瘀组）、心肌缺血型冠心病肾虚血瘀病证结合组（病证结合组），每组5只。

2.2 肾虚血瘀证候模型制造

参照文献[1-4]方法，每日以冰水冷敷大鼠胸前区部位并惊扰大鼠30 min，皮下注射氢化可的松（0.37 mg/100 g），连续7 d制作肾虚血瘀大鼠模型。

2.3 病证结合模型制造

参照文献[5-8]方法，采用左冠状动脉前降支结扎制备心肌缺血型冠心病肾虚血瘀病证结合模型。具体步骤如下：大鼠称重，1%戊巴比妥钠0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉；将其背位固定，头颈部自然伸直并固定，以上界胸骨上缘、下界剑突、左界胸骨左缘、右界左腋中线备皮消毒；用针形电极插入四肢皮下，观察描记心电图；将固定大鼠的木板倾斜至45°，将气管插管贴唇内中线插入气道，将薄棉丝置于管口前1 cm处，棉丝随着管口进出的气流摆动，即可证实插管在气道，固定气管插管；连呼吸机，呼吸频率80次/min，吸呼比1∶2，潮气量3 mL/kg；术区消毒后，以胸骨柄为第二肋标志，定位于第三肋，即左胸心跳搏动最高处，纵行开胸2 cm左右，鈍性分离肌层，打开胸腔，平行于肋间方向放置眼科开睑器，扩大肋间隙，轻撕心包膜以充分暴露心脏，在左心耳下缘与肺动脉圆锥间可以看见左冠状静脉主干走行及其分支，冠状动脉左前降支与之伴行。用持针器夹住5-0带线缝合针在左心耳下缘约2 mm处，沿前降支起始部进针，肺动脉圆锥处下1 mm出针，将左前降支连同少量心肌组织一起结扎，进针深度0.5 mm，宽度2～3 mm；结扎后即刻，心脏表面给予利多卡因注射液1～2滴以防止室性心律失常，减轻心脏负荷；迅速将心脏复位，取出胸腔内的棉球等残留器械，彻底止血后轻柔挤压胸腔排尽气体，使胸腔恢复负压；观察心电图造成左前降支梗死缺血图后缝合。

造模成功的标志是结扎部位以下心肌颜色变浅、呈灰白色，监测心电图肢导出现以下标准之一[9]：ST段弓背向上，J点抬高1.5 mV；T波低平（50%）、双向、倒置；ST段下移0.5 mV。逐层缝合肋骨、肌肉和皮肤，关闭胸腔，碘伏处理切口；恢复自主呼吸后去除呼吸机。腹腔注射利多卡因注射液0.1～0.2 mL防止心律失常。腹腔注射青霉素20万U/d，连续3 d，抗感染。术后7 d皮下注射0.37 mg/100 g氢化可的松，促进大鼠肾虚证模型形成。全部手术过程在30 min内完成，严格无菌操作。术前、术后分别记录心电图。术后单笼饲养，3 d后合笼。

2.4 肾虚血瘀证动物模型的中医证候标准

根据全国中西医结合虚证及老年病研究专业委员会修订的虚证辨证参考标准[10]及中西医结合学会活血化瘀专业委员会制定的血瘀证辨证标准[11]，肾虚血瘀证有“心悸、胸闷心痛、畏寒肢冷、舌淡紫、脉弱而涩或结代”等表现，并伴有不同程度的活动障碍。本研究分别以心率、呼吸、体温来代表“心悸”“胸闷心痛”“畏寒肢冷”，同时观察体质量重变化替代全身状况变化，测量血液流变学指标以衡量血瘀程度，以心电图衡量由心脏冠脉前降支结扎手术后导致的心脏供血障碍程度。

2.5 观察指标

2.5.1 一般情况 观察大鼠精神状态、活动情况、皮毛色泽、大小便等。

2.5.2 体质量 记录大鼠造模前后体质量变化。

2.5.3 体温 手术前、采血前分别以电子体温计测量肛温。以温度计金属探头插入肛门约2 cm处，持续1 min，以温度计数值恒定不变为标准。

2.5.4 呼吸频率 手术与采血前1 h，大鼠安静状态测量每分钟呼吸次数。

2.5.5 心率及心电图 大鼠四肢皮下插入电极连接RM6240C多道生理信号采集处理系统，实验仪与电脑相连输出，在大鼠安静状态下记录体表心电图，以连续10个RR间期的均值计算心率，并分析有无心肌缺血表现。

2.5.6 血液流变学指标 病证结合组造模后第7日麻醉各组动物，腹腔取血5 mL，加入肝素抗凝管中，用SA-6000全自动血流变测试仪测定不同切变率全血黏度、卡松黏度。

3 统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，符合正态分布的2组间比较用t检验，非正态分布的2组间比较用Wilcoxon检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

在证候造模过程中，肾虚血瘀组死亡2只，存活13只分别为正常组5只、肾虚血瘀组3只、病证结合组5只。2组造模后大鼠体质量减轻或者增长缓慢，较正常组和造模前差异均有统计学意义（见表1）。造模后精神不振，倦怠嗜睡，易激惹，遇抓捕精神紧张，可见小便失禁、面目浮肿、活动减少、反应迟缓、畏寒喜暖、毛色淡黯无光泽、大便质稀、舌色红黯或淡紫等肾虚血瘀证表现。2组造模大鼠体温均较正常组和造模前降低（见表2），均出现呼吸急促、呼吸时胸部起伏增大、呼吸频率增快（见表3）。2组造模大鼠心率均较正常组和造模前有所下降，心电图显示肾虚血瘀组大鼠心率较前下降、心电图正常，病证结合组大鼠心率较前下降、心电图异常，3组之间比较差异无统计学意义（见表4）。2组造模大鼠血液流變学指标全血黏度及卡松黏度较正常组升高（见表5）。7 d后心电图显示，与正常组比较，肾虚血瘀组大鼠无心肌缺血表现；病证结合组大鼠为心肌缺血心电图，有ST段弓背向上或T波改变等表现（见图1～图3）。

5 讨论

心肌缺血型冠心病是心血管系统的常见多发病，是由于灌注心脏自身的血液减少，引起心脏供氧不足，心肌能量代谢失调，不能维持心脏正常运作而致的心肌缺血等一系列表现。心肌缺血型冠心病属中医“胸痹”“心痛”等范畴，其病机为首先责之正气虚弱，尤以宗气不足为病之因，心阳亏虚为病之本，肾阴匮乏为病之根。肾阳为一身阳气之根本，对脏腑组织起温煦、气化的作用，肾阳虚损，不能气化肾阴，而致阴阳两虚。肾虚不能温煦，阴寒内盛，凝聚不散，久而血行不畅致肾虚血瘀证，主要表现为心痛、心悸、胸闷、眩晕、甚则昏厥等。本研究旨在探索肾虚血瘀型冠心病心肌缺血病证结合模型的可行性，结果表明，肾虚血瘀组与病证结合组大鼠较正常组和建模前均出现体重减轻、体温降低、呼吸频率增快、心率减慢、血液流变学呈高黏度等表现，且除心电图外，2组大鼠在上述指标的变化上无明显差异，符合中医临床肾虚血瘀证候特点。病证结合组大鼠心电图较肾虚血瘀组有明显不同，病证结合组心电图呈心肌缺血型改变。

心电图改变是心肌缺血型冠心病的首要诊断依据。冠状动脉前降支结扎后，供血不足，因此心电图发生改变；而非疾病肾虚心阳瘀阻证候模型并未造成心脏实质性病变，仅发生中医病理功能性改变，故而其心电图没有出现心肌缺血表现。实验结果显示，结扎冠状动脉前降支并注射氢化可的松建立心肌缺血型冠心病肾虚血瘀病证结合模型可行且模型稳定。

本实验所建立的心肌缺血型冠心病肾虚血瘀病证结合模型，是在手术建立西医疾病模型的基础上，并不施加人为因素，而是通过观察疾病模型建立成功后的证候表现，并将之与传统中医肾虚血瘀模型相对照，比较其证候是否符合中医肾虚血瘀证的特点，从而确定建模后动物所表现的中医证型。这种方法更能体现病证结合的内涵，符合中医先诊病后辨证的临床实际。陈氏等[12]研究发现，治疗冠脉结扎法建立的大鼠急性心肌缺血模型以失笑散和瓜蒌薤白白酒汤疗效分居一二，提示冠脉结扎法可致心肾虚血瘀证型。此外，以冠状动脉前降支结扎法可成功建立心肌缺血型冠心病肾虚血瘀病证结合模型，从另一方面也印证了临床心肌缺血型冠心病患者中医病理变化大多属于肾虚血瘀证。该心肌缺血型冠心病模型前降支结扎后心肌供血供氧不足，心脏能量代谢异常，心脏收缩能力减弱，导致血液流行不畅，血液流变学显示血黏度增高，同时大鼠有舌色淡紫或紫黯，体现了中医“因虚致瘀”的表现。且从中医证候变化上衡量该模型，符合肾虚为本、因虚致瘀、血瘀为标的病理实质。我们前期研究表明，滋肾活血方治疗心肌缺血型冠心病安全有效[13-14]，其疗效机制可能与改善心肌供氧供血有关。

参考文献：

[1] 张硕辛.病态窦房结综合征阳虚血瘀大鼠病症结合模型的研究[D].哈尔滨：黑龙江中医药大学，2014.

[2] 李长禄.肾虚型老年痴呆大鼠模型的建立及药物验证[D].北京：北京协和医学院，2013.

[3] 陈益丹，沈蓉，张志雄.氢化可的松“虚证”模型大鼠的心率变异性研究[J].上海中医药大学学报，2007，21（1）：40-42.

[4] 杜江，李楠，王和鸣.肾虚模型造模方法及相关指标[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（50）：9433-9436.

[5] 贺海波，许佳，徐媛青，等.竹节参总皂苷预处理对冠脉结扎致大鼠急性心肌缺血损伤的影响[J].中药材，2012，35（5）：744-749.

[6] 王馨.益气活血方对大鼠心肌缺血及闰盘相关蛋白表达的影响[D].哈尔滨：黑龙江中医药大学，2012.

[7] 刘涛，徐秋玲，王伟，等.气虚血瘀证大鼠模型缺血心肌蛋白质组学研究[J].江苏中医药，2010，42（7）：67-69.

[8] 谭双，王彦云，刘如秀，等.强心复脉颗粒对兔右冠状动脉缺血再灌注心律失常的干预作用[J].中国中西医结合杂志，2008，28（1）：51-53.

[9] 章忱，盛学仕，吕嵘，等.动物心肌缺血中医证型规范化标准化研究（二）[J].上海中医药杂志，2003，37（3）：42-45.

[10] 沈自尹，王文健.中医虚证辨证参考标准[J].中西医结合杂志，1986， 6（10）：598.

[11] 中国中西医结合研究会活血化瘀专业委员会.血瘀证诊断标准（1986年11月修订）[J].中西医结合杂志，1987，7（3）：129.

[12] 陈世宏，叶耘，尚正录，等.不同治法对大鼠心肌缺血模型中医证型的反证研究[J].上海中医药大学学报，2005，19（4）：36-38.

[13] 刘如秀，刘宇，徐利亚，等.刘志明从肾论治胸痹[J].四川中医，2013， 31（2）：1-3.

[14] 刘如秀，徐利亚，刘金凤，等.滋肾通阳活血方联合西药治疗冠心病心绞痛临床研究[J].中国中医药信息杂志，2014，21（8）：23-26.

（收稿日期：2015-02-04；编辑：华强）