HPLC同时测定复方藤乌软膏中6种乌头类生物碱含量

李美艳 赫清雪 王爱武

摘要：目的 建立高效液相色谱法（HPLC）同时测定复方藤乌软膏中6种乌头类生物碱含量的方法。方法 色谱柱为Agilent XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A为乙腈-四氢呋喃（25∶8），B为0.1 mol/L醋酸铵溶液（每1000 mL加冰醋酸0.5 mL），梯度洗脱；流速：1 mL/min；检测波长：235 nm；柱温：25 ℃。结果 乌头碱在0.072～0.648 μg具有良好的线性关系（r=0.999 5），平均回收率为99.29%，RSD=1.25%；新乌头碱在0.062～0.648 μg具有良好的线性关系（r=0.999 5），平均回收率为99.12%，RSD=0.85%；次乌头碱在0.064～0.384 μg具有良好的线性关系（r=0.999 8），平均回收率为99.57%，RSD=1.07%；苯甲酰乌头原碱在0.056～0.672 μg具有良好的线性关系（r=0.999 2），平均回收率为98.11%，RSD=0.61%；苯甲酰新乌头原碱在0.055～0.993 μg具有良好的线性关系（r=0.999 9），平均回收率为99.27%，RSD=1.10%；苯甲酰次乌头原碱在0.078～0.702 μg具有良好的线性关系（r=0.999 8），平均回收率为99.08%，RSD=1.38%。结论 本方法操作简便、灵敏度高、重复性好，结果准确，可作为复方藤乌软膏中乌头类生物碱的含量测定方法。

关键词：复方藤乌软膏；乌头碱；新乌头碱；次乌头碱；苯甲酰乌头原碱；苯甲酰新乌头原碱；苯甲酰次乌头原碱；高效液相色谱法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.024

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）09-0087-04

Simultaneous Determination of 6 Aconitum Alkaloids in Compound Tengwu Ointment by HPLC LI Mei-yan1，2， HE Qing-xue1，2， WANG Ai-wu1 （1.Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University， Jinan 250021， China；2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China）

Abstract：Objective To establish an HPLC method for the simultaneous determination of the 6 aconitum alkaloids in compound Tengwu Ointment. Methods Chromatographic column was Aglient XDB-C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm）， with the mobile phase A of acetonitrile- tetrahydrofuran （25∶8）， phase B was 0.1 mol/L ammonium acetate solution （0.5 mL acetic acid added to the 1000 mL） with gradient elution；the flow rate was 1 mL/min；the detection wavelength was set at 235 nm；the column temperature was 25 ℃. Results Aconitine was in the good linear range of 0.072-0.648 μg （r=0.999 5）， with the average recovery of 99.29%， RSD=1.25%. Mesaconitine was in the good linear range of 0.062-0.648 μg （r=0.999 5）， with the average recovery of 99.12%， RSD=0.85%. Hypaconitine was in the good linear range of 0.064-0.384 μg （r=0.999 8）， with the average recovery of 99.57%， RSD=1.07%. Benzoylaconine was in the good linear range of 0.056-0.672 μg （r=0.999 2）， with the average recovery of 98.11%， RSD=0.61%. Benzoylmesaconine was in the good linear range of 0.055-0.993 μg （r=0.999 9）， with the average recovery of 99.27%， RSD=1.10%. Benzoylhypaconine was in the good linear range of 0.078-0.702 μg （r=0.999 8）， with the average recovery of 99.08%， RSD=1.38%. Conclusion This method is simple， sensitive， repeatable and accurate， which can be used for determination of aconitum alkaloids in compound Tengwu Ointment.

Key words：compound Tengwu Ointment；aconitine；mesaconition；hypaconitine；benzoylaconine；benzoylmesaconine；benzoylhypaconine；HPLC

復方藤乌软膏是山东大学附属省立医院骨伤科专家与药学人员遵循中医药理论共同研制的传统中药制剂，由鸡血藤、生川乌、生草乌、自然铜等组成，具有消肿止痛、续筋接骨等功效，主要用于治疗运动劳损、急性扭伤、挫伤、闪伤及轻度骨折引起的疼痛，临床应用30余年疗效较好。

复方藤乌软膏中的生川乌、生草乌含有乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱等乌头类生物碱，既是毒性成分又是有效成分[1]。我们前期对其制备工艺及皮肤安全性进行了研究[2]。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）建立复方藤乌软膏中6种乌头类生物碱的含量测定方法，为更好地控制其质量、进一步推广和扩大应用奠定基础。

1 仪器与试药

Waters 600F高效液相色谱仪（Waters2996紫外检测器，Empowers色谱工作站），Agilent XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；CP2250型电子分析天平（奥豪斯国际贸易有限公司）；BSA223S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ-600DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

复方藤乌软膏样品（批号分别为20140508、20140711、20140829），山东大学附属省立医院制剂室制备；乌头碱对照品（批号110720-200410，纯度≥98%）、新乌头碱对照品（批号0799-9403，纯度≥98.3%）、次乌头碱对照品（批号0798-9403，纯度≥98.6%）均购自中国食品药品检定研究院，苯甲酰乌头原碱对照品（批号RFS-B-110305，纯度≥98%）、苯甲酰新乌头原碱对照品（批号RFS-B-100713，纯度≥98%）、苯甲酰次乌头原碱对照品（批号RFS-B-110328，纯度≥98%）均购自成都瑞芬思生物科技有限公司；乙腈、四氢呋喃为色谱纯，水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流动相A为乙腈-四氢呋喃（25∶8），流动相B为0.1 mol/L醋酸铵溶液（每1000 mL加冰醋酸0.5 mL），梯度洗脱（0→35 min，17%→25%A；35→60 min，25%A）；检测波长：235 nm；柱温：25 ℃；流速：1 mL/min。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于3000。在此色谱条件下，6种乌头类生物碱均与其他组分能达到较好分离。色谱图见图1。

3.苯甲酰次乌头原碱；4.新乌头碱；5.次乌头碱；6.乌头碱

图1 复方藤乌软膏中6种乌头类生物碱HPLC图

2.2 对照品溶液的制备

精密称取乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，分别置于10 mL容量瓶中，加入0.05%盐酸-甲醇溶液定容至刻度，制成每毫升含乌头碱0.180 mg、新乌头碱0.180 mg、次乌头碱0.180 mg、苯甲酰乌头原碱0.560 mg、苯甲酰新乌头原碱0.460 mg和苯甲酰次乌头原碱0.195 mg的对照品储备液。

精密量取乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱及苯甲酰次乌头原碱储备液各2.0、2、0、1.0、1.0、1.2、2.0 mL，置于同一10 mL容量瓶中，加入0.05%盐酸-甲醇溶液稀释至刻度，制成每毫升含乌头碱36 ?g、新乌头碱36 ?g、次乌头碱32 ?g、苯甲酰乌头原碱56 ?g、苯甲酰新乌头原碱55.2 ?g和苯甲酰次乌头原碱39 ?g的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取复方藤乌软膏约10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液3 mL，加入异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液30 mL，超声处理（功率100 W，频率40 kHz，温度25 ℃）30 min，过滤，残渣用异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液洗3次，每次10 mL，合并滤液，回收溶剂，残渣用0.05%盐酸-甲醇溶液定容至2 mL，过0.45 ?m微孔滤膜，即得。

2.4 线性关系考察

分别吸取混合对照品溶液2、6、10、14、18 ?L，按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，分别进行线性回归，得回归方程，结果见表1。

2.5 精密度试验

取混合对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱峰面积RSD分别为0.92%、1.27%、1.69%、1.71%、2.12%、2.24%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取复方藤乌软膏，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、12 h对样品进行测定，记录积分峰面积，结果供试品中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱及苯甲酰次乌头原碱峰面积的RSD分别为1.37%、1.56%、1.18%、0.94%、2.17%、1.89%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

取同一批复方藤乌软膏，按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。测得样品中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱及苯甲酰次乌头原碱峰面积的RSD分别为1.75%、2.15%、1.77%、1.41%、1.35%、1.88%，结果表明本方法重复性较好。

2.8 加样回收率试验

取6份已知含量的复方藤乌软膏，每份约5 g，精密称定，分别精密加入一定浓度的6种乌头类生物碱混合对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果见表2。

2.9 含量测定

取3批复方藤乌软膏，各约10 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果见表3。

3 讨论

复方藤乌软膏中，生川乌、生草乌所含的双酯型生物碱（乌头碱、新乌头碱和次乌头碱）治疗量与中毒量接近，经加工炮制后转化为单酯型生物碱（苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱），毒性大大降低[3]。目前关于含有乌头碱的中药含量测定报道较多，但同时测定6种生物碱的方法少见。本研究对乌头碱的提取方法、萃取溶剂和流动相的种类及梯度洗脱条件进行了反复考察和试验，建立了同时测定复方藤乌软膏6种乌头类生物碱含量的方法。

参考乌头类生物碱含量测定的相关报道[4-5]，以6种乌头类生物碱含量为指标，考察了样品中乌头类生物碱的3种提取方法：①氨试液碱化，用乙醚提取后再用0.05 mol/L盐酸萃取，最后用氨水调节pH到10， 再用乙醚萃取的碱化酸提法；②用0.05 mol/L盐酸酸化，乙酸乙酯萃取，水层用氨试液调节pH到10，再用乙醚萃取的酸化碱提法；③氨试液碱化，用异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）超声提取。结果发现，法①干扰杂质最少，但提取率相对低，损失较多；法②萃取过程容易乳化，提取率也较低；法③提取率最高，先将样品碱化，使乌头类生物碱游离出来，再用有机溶剂提取的方法干扰少，简便易行，提取效果较好。

对碱化后的萃取溶剂分别以乙醚、异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）进行了考察，结果发现，乙醚作为提取溶剂，回收较为容易、杂质较以异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）为溶剂者少，但提取率低于后者，原因可能为异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液溶解范围大于乙醚，故选择异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液作为提取溶剂。

参考文献[6-8]考察了甲醇-水-氯仿-三乙胺、乙腈-0.1 mol/L醋酸铵溶液梯度洗脱、[乙腈-四氢呋喃（25∶8）]-[0.1 mol/L醋酸铵溶液（每1000 mL加冰醋酸0.5 mL）]梯度洗脱等流动相条件。结果发现，甲醇-水-氯仿-三乙胺体系，6种生物碱分离度不理想，出峰时间在20 min以内。乙腈-0.1 mol/L醋酸铵溶液体系，苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱及新乌头碱分离度较好，出峰时间在20～45 min之间，但乌头碱与次乌头碱峰重叠，无法分离。通过调节pH、醋酸铵浓度等方法，发现醋酸铵浓度对样品分离作用不大，当调节pH到9.5时，6种生物碱达到基线分离，色谱峰对称性良好，但是pH 9.5为强碱性，对标准填料色谱柱损伤较大。最终选择[乙腈-四氢呋喃（25∶8）]-[0.1 mol/L醋酸铵溶液（每1000 mL加冰醋酸0.5 mL）]梯度洗脱。

总之，本研究在提取溶剂、萃取方法及流动相等反复优选的基础上，成功建立了HPLC同时测定复方藤乌软膏6种乌头类生物碱含量的方法，操作简便可行、灵敏度高、重复性好、结果准确，不仅可作为复方藤乌软膏的含量测定方法，也為含乌头碱类其他相关制剂的含量测定提供了借鉴。

参考文献：

[1] 瞿建刚.乌头类药物的毒性和用量探讨[J].北方药学，2013，10（11）：12.

[2] 赫清雪，王爱武，王楠楠.复方藤乌软膏制备及皮肤安全性考察[J].辽宁中医药大学学报，2013，20（15）：75-76.

[3] 涂瑶生，全智慧，孙冬梅，等.制川乌炮制过程中生物碱类成分的时量变化关系[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（6）：25-29.

[4] 李耿，张敏敏，赵亚，等.HPLC法同时测定乌头属不同药材4种生物碱的含量[J].中药材，2012，35（6）：927-930.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：36-37.

[6] 倪洁.HPLC法测定中药饮片制川乌、制草乌中乌头碱、次乌头碱的含量[J].亚太传统医药，2013，9（8）：29-30.

[7] 任欣欣，李兴华，叶莎，等.HPLC测定复脉灵胶囊中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的含量[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（18）：131-134.

[8] 张聿梅，谢黔锋，鲁静，等.草乌药材标准修订研究[J].药物分析杂志， 2010，30（5）：940-942.

（收稿日期：2015-02-06）

（修回日期：2015-03-03；编辑：陈静）