P16蛋白在正常宫颈、CIN、宫颈癌组织中的表达差异及意义

钟伟珍 唐忠庆 严敏莉

【摘  要】目的：探討P16蛋白在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变（cervicalintraepithelialneoplasias，CIN）、宫颈癌组织中的表达差异及意义。方法：收集本院2012年10月～2013年10月行除的宫颈癌（3例）、CINⅡ、Ⅲ（61例）组织的石蜡标本64例进行研究，并收集30例正常宫颈组织标本作为对照组。利用免疫组织化学技术对所有标本进行检测，得出其中的P16蛋白表达情况。结果：在CIN组织和宫颈癌组织中，较之正常的宫颈组织，p16蛋白的阳性表达率显著增加。而将宫颈癌组织与正常宫颈组织，以及正常宫颈组织和CIN组织，还有CIN组织与宫颈癌组织进行两两对比，可以发现不同组织的p16蛋白阳性表达率经比较均存在显著差异。结论：16蛋白在正常宫颈、CIN以及宫颈癌组织中的表达存在较大的差异，临床可以将16蛋白作为宫颈癌筛查的重要指标之一。

【关键词】宫颈;宫颈上皮内瘤变（cervicalintraepithelialneoplasias，CIN）;宫颈癌;P16蛋白;表达

宫颈上皮内瘤变（cervicalintraepithelialneoplasias，CIN）是一组与宫颈癌关系较为密切的病变，研究发现，P16蛋白是一种抗癌基因，广泛存在于人体的宫颈细胞之中，与宫颈上皮内瘤变等关系密切^[1]。一旦，P16蛋白发生变异，便会逐渐转化为恶性细胞。因此，临床积极对p16蛋白正常宫颈和CIN以及宫颈癌组织中的表达水平进行研究，可以帮助人们更好的了解疾病的发生与发展等，提高临床治疗的准确性，具有较强的现实意义^[2]。本研究中，笔者收集本院2012年10月～2013年10月行除的宫颈癌（3例）、CINⅡ、Ⅲ（一共61例）组织的石蜡标本64例进行研究，并收集30例正常宫颈组织标本作为对照组，探讨P16蛋白在正常宫颈、CIN、宫颈癌组织中的表达差异及意义。现将研究结果进行如下报告。

1一般资料和方法

1.1一般资料

收集本院2012年10月～2013年10月行除的宫颈癌（3例）、CINⅡ、Ⅲ（61例）组织的石蜡标本64例进行研究，患者年龄23 ～ 59岁。另外，从同期在本院接受健康体检的健康人群中收集30例正常宫颈组织标本作为对照组。研究获得医学伦理学相关部门同意，所有患者均了解研究相关情况，并签署知情同意书，自愿参与研究。

1.2方法

利用免疫组织化学技术对所有标本进行检测，分析其P16蛋白表达情况。

1.2.1试剂

（1）p16鼠抗人单克隆抗体购自上海天呈医流科技股份有限公司;（2）超敏SP（鼠/兔）试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司;（3）AB酶底物显色剂购自上海领潮生物科技有限公司;（4）PH 6.0枸橼酸缓冲液（自配）（5）0.01MPH7.4 PBS缓冲液（自配）。

1.2.2仪器和设备

（1）医用净化工作台购自北京东联哈尔仪器制造有限公司;（2）单道可调式微量移液器购自上海艾研生物科技有限公司;（3）双目光学显微镜购自上海明兹仪器有限公司;（4）推拿式切片机购自香港万浩科技有限公司;（5）隔水式电热恒温培养箱购自上海玺恒实业有限公司;（6）生物组织摊烤片机购自湖北康益达医疗科技有限公司;

1.2.3检测方法

将购买试剂时提供的p16阳性切片作为阳性对照，将购买磷酸盐缓冲液PBS代替一抗作为阴性对照。利用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接（S-P法）检测不同组织中的p16表达情况。

1.3检测结果判定标准

p16蛋白的蛋白产物位于细胞核或者细胞浆，如果为阳性，则呈黄色或棕黄色。计数：利用100倍显微镜，观察每张切片 10个以上的独立视野，选取其中阳性细胞数最多的5个视野，继续利用400倍视野予以记数，将5个视野平均值作为最终结果。根据阳性细胞比例和分布情况进行判定：（1）阴性（-）：单个细胞染色，阳性细胞数小于5%，（2）弱阳性：（+）小的或散在细胞团染色，阳性细胞数5%～24%;（3）中度阳性（++）：簇状或者片状细胞染色，阳性细胞数25%～50%;（4）强阳性（+++）：弥散细胞染色，阳性细胞数在50%以上。（5）过表达。（++-+++）。本研究中，弱阳性表达以下均计为阴性，过表达视为阳性。

1.4统计学处理

研究所得数据均输入Excel表格，并使用SPSS 公司推出的SPSS 15.0软件进行统计分析，研究所得计数资料均进行Χ²检验，计量资料均进行t检验。并以P<0.05作为差异有统计学意义的标准。

2结果

经统计和检测，p16蛋白在不同宫颈组织中的表达情况存在显著差异，（P<0.05）。其中，在CIN组织和宫颈癌组织中，较之正常的宫颈组织，p16蛋白的阳性表达率显著增加。而将宫颈癌组织与正常宫颈组织，以及正常宫颈组织和CIN组织，还有CIN组织与宫颈癌组织进行两两对比，可以发现不同组织的p16蛋白阳性表达率经比较均存在显著差异。具体结果如表1所示：

表1  p16蛋白在宫颈组织中的表达情况分析

组织分类

例

p16蛋白

阴性（例）阳性（例）

阳性表达率（%）

P

正常组织

CIN

宫颈癌

30

61

3

30

43

1

0

18

2

0

29.5

66.7

/

<0.05

<0.05

3讨论

当人体内出现失控性细胞增殖现象的时候，便会导致各种肿瘤的出现。肿瘤的出现受累于多重遗传和表观遗传水平上的异常，在对各种肿瘤进行诊治的时候，存在较大的难度^[3]。分析原因，是因为肿瘤的其基因组和表观基因组在不同生物层面上具有极度的异质性，在水平上具有极强的可变性^[4]。另外，肿瘤还对各种环境都具有极强的适应性。因此，在对各种类型的肿瘤进行诊断和治疗的过程中，便需要积极的利用各种新型的测序技术，利用各种高效的影像学手段，并寻找新型的分子标志物，以更好的掌握肿瘤发生和发展的相关问题，更好的指导临床治疗等。

3.1宫颈病变

宫颈癌是一种常见的恶性肿瘤，对女性的危害极大。经过大量的研究发现，宫颈上皮内瘤变（cervicalintraepithelialneoplasias，CIN）是一组与宫颈癌关系较为密切的病变。但是，从宫颈病变发展为宫颈癌需要较长的时间，过程较为缓慢^[5]。而且，很多患者在疾病的发生和发展过程并没有表现出特异性的征兆，因此较易出现病情的延误，错失最佳治疗时机。随着临床医学研究水平的不断提高，人们开始对 宫颈癌的发生发展和不同控制细胞的生长、分化的关系等进行研究，并分析肿瘤的发展是否与细胞基因受损之间存在一定的内在联系。经过大量的研究人们发现，当不同控制细胞受到一定的损伤之后，便会激活机体内的癌基因，并导致各种抑癌基因的丢失或失活，从而引发肿瘤的出现。

3.2 p16蛋白

近年来，随着现代细胞分子生物学理论和技术的发展，利用新的生物工程学技术，如克隆与序列分析、DNA重组、分子杂交、单抗和ELISA技术、PCR、限制性长度多态性分析和基因转染等对宫颈癌的癌变过程进行了大量的研究工作。研究发现，宫颈癌的发展过程中，抗癌基因有p53、p16等，以点突变和缺失为主^[6]。这些异常基因在癌变过程的不同时期影响细胞异型增生，癌细胞的分化程度、浸润和转移。p16基因的缺失或表达水平低下以及p53点突变或缺失者癌细胞分化程度低，浸润和转移能力强，故与恶性表型相关。在卵巢癌、子宫颈癌和子宫内膜癌等妇科恶性肿瘤中，均存在p16基因的表达异常^[7]。p16蛋白是一种细胞周期负调控蛋白，又被称为p16/CDKN2基因或者多种瘤抑制因子I（MTS-1）。p16蛋白可以指令细胞停止分裂，发挥出较强的抵御癌症的作用，有效阻击癌细胞，使之停止分裂^[8]。p16蛋白可以有效抑制细胞周期蛋白依赖性激酶，因此对细胞的整个周期过程发挥出较强的“减速”作用。在具体的作用过程中，p16可以积极的与细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）产生特异性的结合，导致其失活^[9]。于是进一步发挥出对细胞周期的反向调节效应，达到“减速”的目的。一旦p16蛋白受到各种因素的影响，出现较强的变异现象，便会对细胞的增殖周期产生较大的影响，导致其出现失控，于是细胞便会呈现出无限生长的情况^[10]。

3.3 p16蛋白与宫颈疾病

大量的研究发现，在各种妇科恶性肿瘤例如宫颈癌中，存在较为明显的p16蛋白异常表达的情况^[11，12]。p16蛋白的异常变化包括了多种类型，例如p16蛋白启动子甲基化和染色体异位以及体细胞突变和基因缺失。不同的因素影响下，均会导致 p16蛋白的异常表达。例如，如果出现p16蛋白启动子甲基化，则会导致基因出现沉默继而基失活，引发宫颈癌。研究发现，在不同病变性质的宫颈组织中，p16 蛋白的表达均会出现不同表达情况^[13]。還有学者经过研究报道，p16蛋白的阳性表达情况和宫颈癌的临床分期之间呈现出明显的正相关关系。其中，宫颈癌Ⅲ期和Ⅳ期病理患者的p16蛋白的阳性表达程度显著低于宫颈癌Ⅰ期、Ⅱ期病理患者^[16]。汪勤^[14]等通过利用免疫组化SP法检测正常子宫颈或炎性病变组织、CIN1～3中的p16蛋白表达情况发现，p16 蛋白表达和子宫颈上皮内瘤变的病变进展之间存在十分密切的联系，因此，通过对检测p16蛋白的表达水平，可以更好的对 临床CIN进行分级诊断，具有一定的临床应用价值。经过大量的研究，学者们普遍认为p16蛋白的实际表达情况和宫颈疾病之间存在较为密切的联系^[15，16]。本研究最终结果显示，在CIN组织和宫颈癌组织中，较之正常的宫颈组织，p16蛋白的阳性表达率显著增加。而将宫颈癌组织与正常宫颈组织，以及正常宫颈组织和CIN组织，还有CIN组织与宫颈癌组织进行两两对比，可以发现不同组织的p16蛋白阳性表达率经比较均存在显著差异。即提示，在正常宫颈、CIN以及宫颈癌组织中，p16蛋白的表达存在较为明显的差异。与其他一些学者的研究结果进行比较，基本一致。

另外，徐东晓等^[17]经过研究发现，在增生期子宫内膜、单纯型增生过长、复杂型增生过长、非典型增生过长和子宫内膜癌中，p16蛋白的表达情况呈现出依次下降的情况。其中，在p16蛋白的实际表达方面，增生期子宫内膜和子宫内膜癌之间存在显著差异（P<0.05）。研究还发现，p16蛋白在子宫内膜癌中表达在淋巴结转移不同情况以及不同组织学分级的组别之中也存在较大的差异，（均P<0.05）。最终，研究学者提出观点，认为p16蛋白 的表达和子宫内膜癌的发生发展之间存在一定的关系，并可以积极的应用对子宫内膜癌的预后之中。但是，受到本研究样本容量和观察时间的影响，对于 p16 和宫颈癌预后之间的关系以及临床应用价值等，并没有予以进一步的研究。因此，本研究还存在一定不足之处。进一步的结果，还需要在今后的研究中不断扩大样本容量，延长研究时间，增加观察指标等，予以进一步的分析探讨。

综上所述，p16蛋白在正常宫颈、CIN以及宫颈癌组织中的表达呈现出较大的差异。其中，p16蛋白的阳性表达发生在宫颈癌和癌前病变整个阶段。因此，对p16蛋白阳性表达的检测，可以积极的应用于临床对宫颈癌的筛查和诊断之中。所以，在今后的林从检测过程中，可以积极的将p16蛋白作为一种特殊的肿瘤标记物进行检测，以更好的提高诊断效果，指导临床治疗。

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