凝胶色谱法测定头孢菌素类药物中高分子杂质的应用心得

祝飚　李蕾

【摘要】实际上，所谓的凝胶色谱法也是一种凝胶色谱技术，更是一种十分快捷、简单的分离分析技术，其由于具备分离效果理想，操作方便等优点，因此受到了相关研究人员的喜爱，并在头孢菌素类药物中高分子杂质测定中得到了十分广泛的应用，具有一定的推广价值。因此，笔者通过结合自身多年实践工作经验，针对采用凝胶色谱法对头孢菌素类药物中高分子杂质的测定进行了详细的论述，简单介绍了相关操作流程，并得出以下相关结论，以供同行业人员参考交流。

【关键词】凝胶色谱法 头孢菌素类药物 高分子杂质 测定

【中图分类号】R927.2 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）02-0220-01

目前，根据大量临床验证研究表明，大部分由抗生素引起的过敏性反应普遍是与药品中含有的高分子杂质有关联。由此，我们可以判断出，高分子杂质含量的多少将会对药品安全性造成极大的影响，甚至还会对人们的身体健康构成威胁。因此，为了保障药物质量，进一步提高药品纯度，防止不良时间的发生，我们必须通过采取相关有效的测定方法，有效检测出头孢菌素类药物中高分子杂质的含量。对此，本文将重点对凝胶色谱法测定头孢菌素类药物中高分子杂质的应用心得进行了阐释。

一仪器与实验准备上的注意事项

通常情况下，在采用凝胶色谱法对头孢菌素类药物中高分子杂质含量进行测定时，必须要严格遵守实验室中相关的检定过程，全面掌握各种仪器设备的操作规范，从而确保测量结果的精确性。

1、仪器准备

在实验的准备阶段中，若是决定采用自行配置的简单仪器设备，就要充分做好检测单元、输液单元以及数据记录处理单元的三方面工作。其中，检测环节是为了保证满足于紫外检测要求，而输液单位则是为实验顺利开展所提供的可靠流速，同时通过对色谱工作站发出模拟信号，以便于后续数据的记录处理。并且，在自行配置仪器系统使用过程中，一定要确保符合液相色谱仪的测定要求，制定出规范合理的检测规程，定期进行检定，以此来保证实验结果的有效性。

2、凝胶色谱柱准备

在色谱柱规格的选择上应该从仪器系统的最大进样能力、所分析样品的溶解能力以及检测限度等方面综合进行考虑。通常凝胶色谱柱的体积小于柱床体积，所以一般头孢菌素抗生素高分子杂质测定的柱床体积应为60ml以上。

3、玻璃柱管的分端及凝胶介质的选取

在玻璃柱管的分端上，一般开口的玻璃柱管可以采用玻璃棉加开口橡胶塞来封端，也可以在一端烧结石英过滤板或者通过直接购买带调节头的商品玻璃柱管。凝胶色谱法在凝胶介质的选取上可选用的凝胶有很多种，目前对抗生素高分子杂质的测定多数采用的是葡聚糖凝胶，选取这种凝胶介质后一定要注意在使用之前需用水充分的溶胀，可以根据需要填制的凝胶柱柱床体积来具体计算用量。如果溶胀使采用蒸馏水浸泡的方式，也可以在温度为4℃的冰箱中放置48小时，也可在水浴中煮沸一小时，这样才能保证溶胀充分。在这两种溶胀方式中都应该注意随时搅拌出去气泡，必要情况下还可以进一步的进行真空脱气。

4、装柱

将溶胀好的凝胶介质用蒸馏水悬浮静置后，每次倾去上层液，以去除凝胶碎屑和杂质。按照这种方法进行多次洗涤，直到上层的精置液澄清为止。实践中可将凝胶介质用水制成悬浆，然后一次性的倒人垂直放置的玻璃柱管中，待凝胶颗粒沉降完毕后即完成装柱。也可在垂直放置的玻璃柱管和漏斗上放开柱管下口，保持液流顺畅，用滴灌逐管从漏斗中加入凝胶悬浆，让凝胶颗粒在蒸馏水中缓慢沉降，注意让漏斗中随时保持一定的凝胶悬浆。运用此种方法会使装柱得时间较长，必要时可以在出柱口增加负压加快装柱时间。

二系统适用性实验

系统适用性试验对溶液的制备更加注重方便性和可操作性，系统适用性试验用溶液的配制方法为用主成分对照品与杂质对照品混合配制，但还是会使得有些杂质对照品不能得到，如性质不稳定或分离提取技术要求太高等，但这些杂质峰恰恰又是与主成分峰最难分离的色谱峰。系统适用性试验目前包括很多内容，主要考察对照品测定系统与高分子杂质测定系统中蓝色葡聚糖2000溶液峰的保留时间的比值，以及理论板数和拖尾因子，以此来控制对照品测定与高分子杂质测定时仪器状态的同一性。在以蓝色葡聚糖2000的保留时间来表示高分子杂质的保留特征时，对照品色谱峰及高分子杂质色谱峰与蓝色葡聚糖2000溶液色谱峰保留时间的比值都应控制在一定的限度内，由此才能实现对色谱柱状态的正常控制。

三操作方法上的注意事项

1、样品溶液及对照溶液的制备

具体操作中必须要按规定的标准来配制样品溶液，由于某些高浓度抗生素溶液具有一定的不稳定性，所以通常對样品溶液采取即溶即进的形式。对照溶液的制备上，要注意头孢菌高分子杂质的含量测定，通常以样品自身在SDS水溶液或纯水中的缔合物作为对照进行定量。在制备缔合物时特别要注意对浓度及水的纯度的控制，以此来保证缔合完全。

2、进样及进样方式

一般我们在对头孢菌素高分子杂质含量进行测定时，通常需要不同状态的流动相，选择出合适的对照溶液进行进样。因此，只有事先将流动相更换之后，才能充分保证凝胶色谱柱的平衡性。并且，笔者建议尽量采用凝胶色谱仪自动进样方式，或是在特殊情况下，选择手动进样。然而，无论是任何一种进样方式，在实验中，都必须保证色谱柱端无缝隙处，从而避免样品扩散，影响分离效果。另外，在对头孢菌素高分子进行自动取样的过程中，也要切实遵守相关的液相色谱操作规程。

3、凝胶面的平整

如果选择了手动进样方式，就一定要保证凝胶表面的平整性和完整性。并在进样之前，事先使用滴管吸取掉凝胶表面积压的液体，确保色谱柱下端能够顺利流通，直到色谱柱内的溶液流降到凝表面时，我们才可以应用相应的定量器具，对样品溶液进行精密的量取。之后，我们还需要将样品溶液滴加到色谱柱的凝胶表面中，同时还要对色谱柱管内壁上残留的样品溶液进行清洗。最后，也是最重要的一个实验环节，相关实验人员要在色谱柱顶端缓慢注入适量的流动相，认真做好进样时间的记录工作。

4、记录对照及结果

要分别记录样品和对照溶液的色谱图，积分对照溶液的峰面积和样品溶液中处于外水体积的高聚物杂质面积，按外标法以峰面积计算样品中高分子杂质的含量。按平行实验的平均值作为样品中高分子杂质含量的最终结果，并与标准规定限度比较后作出是否符合规定的判断。

5、样量分析

在一般高效液相色谱仪上使用凝胶柱，应严格限制泵压。由于一般高压液相色谱管路和检测器通路狭窄，极易发生堵塞，所以要注意尽量减少将出柱液连接到检测器的时间，尤其是新填充的色谱柱更应经水或流动相充分平衡后再连接到检测器。

四结束语

通过实验结果表明，大部分抗生素药物中的高分子杂质已经超出了药物本身的杂质，严重影响了药物质量，残留了部分污染物质，再加之抗生素在贮存过程中，其分子很容易发生聚合反应，最终产生大量的聚合物杂质，大大降低了药品的纯度。因此，采用高效的凝胶色谱法对头孢菌素中的高分子杂质含量的测量是非常至关重要的，操作人员必须严格遵守相应的检测要求，加强对凝胶色谱法的合理运用及改进，进一步提高头孢菌素类型药物的质量和纯度，从而达到理想的治疗效果。

参考文献

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