甘蔗工艺成熟期SS和SPS酶活性与糖分积累的相关性研究

牛俊奇黄静丽赵文慧杨丽涛，2李杨瑞，2

（1.广西大学农学院　亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁　530005；2.中国农业科学院甘蔗研究中心　广西农业科学院甘蔗研究所　农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室　广西甘蔗遗传改良重点实验室，南宁　530007）

甘蔗工艺成熟期SS和SPS酶活性与糖分积累的相关性研究

牛俊奇1黄静丽1赵文慧1杨丽涛1，2李杨瑞1，2

（1.广西大学农学院亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁530005；2.中国农业科学院甘蔗研究中心广西农业科学院甘蔗研究所农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室广西甘蔗遗传改良重点实验室，南宁530007）

以工艺成熟期甘蔗品种GT28（早熟）和ROC22（早中熟）+1叶和不同节间为材料，分析SPS、SS合成和SS分解方向酶活性与节间糖分积累的相关性。结果表明，+1叶中SPS、SS合成和分解方向的酶活性比蔗茎中高，说明+1叶代谢活跃，是蔗茎糖分不断积累的物质基础。节间SPS酶活性与节间锤度、可溶性总糖和蔗糖含量都正相关，GT28节间SPS酶活性比ROC22中高。节间SS合成方向酶活性与锤度和蔗糖含量都负相关，GT28中SS合成方向酶活性比ROC22中低。而SS分解方向酶活性与ROC22节间锤度、可溶性糖和蔗糖含量都呈负相关，与GT28中呈正相关，未达到显著水平。说明成熟期节间SPS和SS合成方向酶活性提高有利于蔗糖的积累，而随着节间成熟，蔗糖含量可能是促使SS酶活性由合成方向向分解方向转化的一个重要调节因子。

甘蔗；蔗糖磷酸合成酶；蔗糖合成酶；蔗糖含量；相关性分析

甘蔗是重要的糖料和能源作物，我国甘蔗糖产量占全国食糖总产量的比例高达90%以上，在国民经济中占有重要地位［1］。甘蔗成熟茎以积累高浓度蔗糖为主，涉及到蔗糖的合成、分解和运输等生理过程，而调控蔗茎中蔗糖积累的关键性因素是存在于快速发育的茎细胞中蔗糖的跨膜运输能力和蔗糖糖代谢相关酶的活性［2］。植物中与蔗糖代谢密切相关的酶主要有3类：蔗糖合成酶（Sucrose synthase，SS）、蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase，SPS）和转化酶（Invertase，INV）。其中合成蔗糖酶类主要是SS合成方向和SPS，而分解蔗糖酶类主要是可溶性酸性转化酶（Soluble acid invertase，SAI）、细胞壁结合转化酶（Cell wall invertase，CIN）、中性/碱性转化酶（Neutral/alkaline invertase，NI）和SS分解方向［3］。葡萄糖、果糖和蔗糖是糖积累的主要产物，而蔗糖代谢相关酶活力水平高低不仅影响含糖量，而且还决定“库”器官中积累糖的成分。

SS是促使蔗糖进入各种代谢途径的关键酶之一。它是一种可逆酶，既能催化蔗糖合成，又可以催化蔗糖分解，其催化的反应是：蔗糖+UDP ←→果糖+UDPG。在植物体中SS有3种存在方式，即存在于细胞质中的可溶性SS、结合与细胞膜上的不溶性SS和结合于肌动蛋白细胞骨架上的不溶性SS。其中胞质中的SS是蔗糖代谢途径中的一个重要控制点，它的活性反映了植物体内蔗糖积累的能力［4］。此外，SS还参与细胞分化与纤维细胞壁合成、调节淀粉合成以及提高植物抗逆性等各种生理活动［5］。

SPS是一个多基因家族，可以分为5大类，共4个家族：SPSⅠ（C家族）、SPSⅡ（A家族）、SPSⅢ（D家族）、SPSⅣ（D家族）和 SPSⅤ（B家族），由于SPSⅢ和SPSⅣ进化关系较近，而归为同一家族［6］。SPS是植物体内光合产物向蔗糖和淀粉分配的关键调控点，与蔗糖的积累呈正相关［7］。它与植物的株高和产量等农艺性状密切相关［8］，并在植物抗逆，如抗寒、抗旱和耐盐过程中起重要作用［9］。

目前对SPS和SS与甘蔗蔗糖积累的相关性研究的比较多，但大部分对SS酶活性研究仅限于合成方向，而对分解方面的酶活性研究的相对较少。本研究在前期分析SAI、CIN、NI和转化酶抑制子与节间蔗糖积累相关性的基础上，继续以工艺成熟期甘蔗品种ROC22和GT28的+1叶和不同节间为材料，分析SPS、SS合成和SS分解方向酶活性与蔗糖积累相关性。本研究旨在探明工艺成熟期甘蔗糖代谢的关键酶SS和SPS活性，以及主要产物的变化规律，为进一步了解甘蔗SPS和SS酶活性变化与蔗茎中蔗糖积累之间的关系奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料 以甘蔗早熟高产高糖品种桂糖28（GT28）和早中熟高产高糖品种ROC22为材料。取材于2012年春种植于广西大学农学院甘蔗资源圃的新植蔗，取材时间为2012年12月22日。采样时以顶端第一片完全展开叶为+1叶，+1叶包裹的节为+1节，由+1节向下节间数逐渐增加［10］，分别取+1叶（L1）、+1节（I1）、+6节（I2）、+11节（I3）、+16节（I4）、+21节（I5）、+26节（I6）和+31节（I7）。每个小区取12株，把节间数相同节去皮，切碎混匀后取样。重复3次。

1.1.2 仪器和试剂 节间锤度测定采用日本爱拓迷你数显折射计PAL-1；酶活性和还原糖含量的测定采用美国伯腾Synergy H1全功能酶标仪；蔗糖含量的测定采用美国Water公司Alliance2695高效液相色谱仪。乙腈、蔗糖均为色谱纯，实验用水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗糖分的测定

1.2.1.1 节间锤度 去掉甘蔗节间叶片和叶鞘，取节间少许茎汁滴于PAL-1数显手持糖度计上，测定蔗汁锤度。测定时温度为16-17.5℃。

1.2.1.2 蔗糖含量测定 将甘蔗节间去皮并切成小块，用液氮研磨成均匀的粉末状。称取2.5 g粉末置于50 mL离心管，加入10 mL 80%乙醇。80℃水浴提取30 min，每隔5 min摇匀一次。12 000 r/min离心15 min，取上清。沉淀用10 mL 80%乙醇重复抽提2次。合并上清液于50 mL离心管中。将其置于90℃水浴锅中水浴3 h（大约），挥发上清液至大约2 mL。吸取上清液定容到10 mL。用0.22 μm过滤除去杂质，得到糖分提取液。采用HPLC法测定样品中的蔗糖含量。色谱分析条件为：分析柱为YMC-Pack NH2carbohydrate column（250×4.6 mm，5 μm）、株温40℃和流速1 mL/min，进样量为20 μL。乙腈∶水为80∶20，时间20 min。

将上述糖分提取液进行适度稀释后，采用硫酸蒽酮法测定样品中的可溶性总糖含量。

1.2.2 酶的提取和测定 准确称取用液氮研磨的2 g粉末放入10 mL离心管中，加8 mL酶提取液，在冰上震荡提取30 min。于4℃，15 000 r/min离心10 min，取上清液4 mL放入2 mL离心管中。SPS酶活性测定参照Gutiérrez-Miceli［11］，而SS分解方向和合成方向酶活性测定参照Schäfer等［12］的方法，并略做改动。

1.2.3 统计分析 采用Excel 2007进行数据处理，用SPSS 15.0进行显著性和相关性分析。

2 结果

2.1 甘蔗节间锤度分析

随着节间数的增加，GT28和ROC22的节间锤度整体上都呈逐渐增加的趋势（图1）。在相同节间，GT28节间锤度都高于ROC22中，且达到显著差异水平。GT28和ROC22上部节间（+6-+16）平均锤度/下部节间（+21-+31）平均锤度比值分别为0.94和0.95，说明两个品种都已达到工艺成熟期。

图1 甘蔗不同节间锤度分析

2.2 甘蔗不同组织中可溶性总糖和蔗糖含量变化分析

在甘蔗工艺成熟期，GT28和ROC22从+1叶到+31节可溶性总糖含量整体上呈现出逐渐增加的趋势，其中+1叶、+1节间和+6-+31节间之间，可溶性总糖含量均达到极显著差异水平（图2-A）。在GT28中，从+1叶到+31节间蔗糖含量逐渐增加趋势，蔗糖含量在+31节达到最大。而在ROC22中节间蔗糖含量整体上也呈现出逐渐增加的趋势，但在+21节和+31节蔗糖含量有所降低（图2-B）。在2个品种的相同节间，GT28中可溶性总糖和蔗糖含量都显著大于ROC22中的蔗糖含量，这可能与GT28比ROC22品种早熟有关，而在+1叶中可溶性总糖和蔗糖含量在两个品种间均无明显差异。

图2 工艺成熟期甘蔗+1叶和不同节间可溶性糖（A）及蔗糖（B）含量变化

2.3 SS合成方向酶活性变化分析

在甘蔗工艺成熟期，ROC22中+1叶和节间SS合成方向酶活性都显著高于GT28相同部位酶活性（图3）。2个品种+1叶中SS合成方向酶活性都极显著大于节间SS合成方向酶活性。从+1叶到+31节间，节间SS合成方向酶活性在两个品种间整体上都呈现出逐渐降低的趋势。

2.4 SS分解方向酶活性变化分析

在甘蔗工艺成熟期，2个品种中SS分解方向酶活性在+1叶中的酶活性都极显著差异于节间中的酶活性（图4）。在ROC22中，+1叶中SS分解方向酶活性显著大于GT28中的酶活性。从+1节间到+31节间，ROC22中SS分解方向酶活性表现为逐渐降低的趋势，除了+1节间SS分解方向酶活性显著高于GT28中的酶活性外，其余节间SS分解方向酶活性均低于GT28中的酶活性。

图3 工艺成熟期甘蔗+1叶和不同节间SS合成方向酶活性分析

图4 工艺成熟期甘蔗+1叶和不同节间SS分解方向酶活性分析

2.5 SPS酶活性变化分析

在甘蔗工艺成熟期，GT28的+1叶和不同节间中SPS酶活性都高于ROC22相同部位的SPS酶活性，其中除了+11节间外，酶活性均达到显著水平（图5）。2个品种+1叶中SPS酶活性都高于节间中的酶活性。2个品种节间SPS酶活性整体上呈逐渐升高的趋势。在GT28中，SPS酶活性逐渐升高，在+31节间达到最大，其中+1节间、+6-+11节间、+16-+21节间和+26-+31节间之间，SPS酶活性差异都达到极显著水平，而在ROC22不同节间酶活性也表现出相同趋势。这说明蔗茎从上部到下部节间SPS酶活性呈现梯度差异，而成熟节间SPS酶活性提高，有利于高浓度的蔗糖积累。

图5 工艺成熟期甘蔗+1叶和不同节间SPS酶活性分析

2.6 节间蔗糖分与SS和SPS相关性分析

在蔗茎中，GT28和ROC22节间锤度、可溶性总糖和蔗糖含量之间都呈极显著正相关（表1）。2个品种SPS酶活性与节间锤度、可溶性总糖和蔗糖含量也呈显著正相关。ROC22中SS合成方向酶活与节间锤度、可溶性总糖和蔗糖含量呈极显著负相关，而在GT28中除节间可溶性总糖没有达到显著负相关外，节间锤度和蔗糖含量均达到显著负相关。SS分解方向酶活性，在GT28中与节间锤度、可溶性总糖和蔗糖含量呈正向关，但未达到显著水平，而在ROC22中，SS分解方向酶活性与节间锤度、可溶性总糖和蔗糖含量均达到极显著负相关。而节间SS合成方向和分解方向酶活性均与SPS酶活性呈显著负相关。

3 讨论

在甘蔗工艺成熟期，GT28和ROC22 +1功能叶中SPS、SS合成和分解方向酶活性都高于茎中，且维持较高水平，说明此时+1叶片代谢仍然活跃，为蔗茎糖分不断积累提供物质基础。甘蔗+1叶中可溶性总糖和蔗糖含量，都极显著低于节间中的含量。而蔗糖由“源”叶中运输到甘蔗茎中，主要是受蔗茎细胞中蔗糖代谢相关酶的活性和蔗糖的跨膜运输能力调节，而不是作为源叶中输出光合产物的能力和韧皮部运输蔗糖的效率调节［2，13］。

表1 甘蔗节间SPS、SS合成方向和分解方向酶活性与蔗糖分的相关性分析

糖信号不仅能维持库器官的生长，也是调节源库代谢的信号分子。通过对库器官蔗糖代谢相关酶活性的调节，进而影响库器官中糖分的积累［14］。在甘蔗早熟品种GT28节间中SS合成方向酶活性都显著低于早中熟ROC22中的酶活性，而其节间蔗糖含量高于ROC22中的蔗糖含量，说明早熟品种随着蔗茎的成熟，节间蔗糖含量增加，从而抑制SS合成方向酶活性。而晚熟品种由于蔗糖含量低，SS合成方向酶活性仍然保持较高水平。相关性分析表明，2个甘蔗品种节间锤度、可溶性总糖和蔗糖含量都与SS合成方向酶活性呈显著的负相关。这与Botha和Black［15］研究结果是一致的。

在甘蔗不同发育时期，4个甘蔗品种未成熟茎中SS合成方向酶活性都高于成熟茎中的酶活性，蔗糖含量是调节SS合成方向酶活性的重要因子［16］。在GT28中，+6-+31节间SS分解方向酶活性高于ROC22中的酶活性，说明随着节间成熟蔗糖含量到达一定程度，可能会抑制SS合成方向酶活性，而SS分解方向酶活性被激活。相关性分析表明，ROC22中SS分解方向的酶活性与节间锤度、可溶性总糖和蔗糖含量都达到极显著的负相关，而在GT28中呈正相关（未达到显著水平），进一步说明节间SS分解方向酶活性可能受节间蔗糖含量的调节。目前已经从甘蔗叶中分离到A、B和C三种SS酶类［17］，Schäfer［12］研究表明甘蔗未成熟节间和成熟节间可能存在两种不同的SS酶类，但它们如何在蔗茎蔗糖积累中发挥作用尚不清楚。

甘蔗茎中SPS酶活性与蔗糖的积累呈正相关［11，18］。在工艺成熟期，2个甘蔗品种SPS酶活性与节间锤度、可溶性总糖和蔗糖含量都呈正相关，且早熟高糖品种GT28中节间蔗糖含量和节间SPS酶活性都显著高于ROC22相同节间蔗含量和SPS酶活性，这说明SPS酶活性不仅与节间蔗糖积累密切相关，而且与甘蔗的成熟度有关。陈兰平等［19］的研究也表明，随着蔗茎的成熟，SPS家族基因（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ）在高糖品种中的优势表达基因减少，而低糖品种中的优势表达基因增加，可能与低糖品种后期大量积累蔗糖有关。

转化酶活性的降低、SPS酶活性的增加以及蔗糖合成酶分解活性的下降和合成活性的增加，是引起甜瓜果实蔗糖积累的主要内在因子［20］。大豆籽粒中的蔗糖含量并非受某一种酶绝对调控，SPS活性与SS+AI+NI活性总和之差与籽粒中蔗糖的积累显著正相关［21］，说明库器官中糖分的积累过程是蔗糖合成和分解酶类共同协作进行调节的，而不是某类酶在单独发挥作用［22］。本课题组前期研究结果表明，在甘蔗工艺成熟期节间蔗糖含量与节间SAI酶活性呈显著负相关，与CIN酶活性呈显著正相关，转化酶抑制子基因在调节转化酶活性中发挥重要作用。这也说明甘蔗节间蔗糖积累，可能是蔗糖代谢相关酶共同调节而进行蔗糖积累的。因此研究甘蔗茎中锤度、可溶性糖含量和蔗糖含量及其与相关酶活性的变化，可为进一步研究甘蔗SS、SPS表达调控机理，提高甘蔗茎的含糖量，培育品质优异的甘蔗新品种提供参考。

4 结论

甘蔗节间SPS酶活性与锤度、可溶性总糖和蔗糖含量呈显著正相关，且早熟高糖品种GT28中SPS的酶活性高于早中熟品种ROC22。节间SS合成方向酶活性与节间锤度和蔗糖含量都呈显著负相关，GT28节间酶活性比ROC22中的低。而节间锤度、可溶性糖和蔗糖含量与ROC22中SS分解方向酶活性呈显著的负相关，而与GT28中SS分解方向酶活性呈正相关，未达到显著水平。这说明节间SPS和SS合成方向酶活性提高有利于蔗糖积累，而随着节间成熟，蔗糖含量可能是促使SS合成酶由合成活性向分解活性转化的一个重要调节因子。

［1］李杨瑞， 杨丽涛. 20世纪90年代以来我国甘蔗产业和科技的新发展［J］. 西南农业报， 2009， 22（5）：1469-1475.

［2］赵丽宏， 王俊刚， 杨本鹏， 等. 甘蔗体内的蔗糖积累［J］. 基因组学与应用生物学， 2009， 28（2）：385-390.

［3］Sturm A. Invertases：Primary structures， functions and roles in plant development and sucrose partitioning［J］. Plant Physiol， 1999， l21（1）：l-8.

［4］Winter H， Huber SC. Regulation of sucrose metabolism in higher plants：localization and regulation of activity of key enzymes［J］. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology， 2000， 35（4）：253-289.

［5］卢合全， 沈法富， 刘凌霄， 等. 植物蔗糖合成酶功能与分子生物学研究进展［J］. 农业生物技术科学， 2005， 21（7）：34-37.

［6］Castleden K， Naohiro A， Gillespie VJ， et al. Evolution and function of the sucrose-phosphate synthase gene families in wheat and other grasses［J］. Plant Physiol， 2004， 135（3）：1753-1764.

［7］Grof CPL， A lbertson PL， Bursle J， et al. Sucrose-phosphate synthase， a biochemical marker of high sucrose accumulation in sugarcane［J］. Crop Science， 2007， 47（4）：1530-1539.

［8］Ishimaru K， Ono J， Kashiwagi T. Identification of a new gene controlling p lan t height in rice using the candidate-gene strategy［J］. Planta， 2004， 218：388-395.

［9］刘洪博， 陆鑫， 毛钧， 等. 甘蔗蔗糖磷酸合成酶研究进展［J］.湖南农业大学学报， 2013， 39（1）：31-36.

［10］Rae AL， Perroux JM， Grof CP. Sucrose partitioning between vascular bundles and storage parenchyma in the sugarcane stem：a potential role for the ShSUT1 sucrose transporter［J］. Planta，2005， 6：817-825.

［11］Gutiérrez-Miceli FA， Rodriguez-Mendiola MA， Alejo NO， et al. Relationship between sucrose accumulation and activities of sucrose-phosphatase， sucrose synthase， neutral invertase and soluble acid invertase in micropropagated sugarcane plants［J］. Acta Physiologiae Plantarum， 2002， 24（4）：441-446.

［12］ Schäfer WE， Rohwer JM， Botha FC. Protein-level expression and localization of sucrose synthase in the sugarcane culm［J］. Physiologia Plantarum， 2004， 121：187-195.

［13］ Uys L， Botha FC， Hofmeyr JH， et al. Kinetic model of sucrose accumulation in maturing sugarcane culm tissue［J］. Phytochemistry， 2007， 68（16-18）：2375-2392.

［14］McCormick AJ， Watt DA， Cramer MD. Supply and demand：sink regulation of sugar accumulation in sugarcane［J］. Journal of Experimental Botany， 2009， 60（2）：357-364.

［15］Botha FC， Black KG. Sucrose phosphate synthase and sucrose synthase activity during maturation of intenodal tissue in sugarcane［J］. Aust J Plant Physiol， 2000， 27：81-85.

［16］Verma AK， Upadhyay SK， Verma PC， et al. Functional analysis of sucrose phosphate synthase（SPS）and sucrose synthase（SS）in sugarcane（Saccharum）cultivars［J］. Plant Biology， 2011， 13：325-332.

［17］Schäfer WE， Rohwer JM， Botha FC. Partial purification and characterisation of sucrose synthase in sugarcane［J］. Journal of Plant Physiology， 2005， 162：11-20.

［18］Pan YQ， Luo HL， Li YR. Soluble acid invertase and sucrose phosphate synthase：key enzymes in regu lationg sucrose accumulation in sugarcane stalk［J］. Sugar Tech， 2009， 11（1）：28-33.

［19］陈兰平， 陈由强， 方静平， 等. 甘蔗SPS基因家族成员表达与糖分积累关系解析［J］. 热带作物学报， 2014， 35（7）：1354-1361.

［20］张明方， 李志凌， 陈昆松， 等. 网纹甜瓜发育果实糖分积累与蔗糖代谢参与酶的关系［J］. 植物生理与分子生物学学报，2003， 29（5）：455-462.

［21］李彦生， 南海洋， 杜明， 等. 菜用大豆籽粒不同部位蔗糖积累及关键酶活性［J］. 作物学报， 2013， 39（11）：2099-2105.

［22］李丹， 王晔， 赫磊， 等. 甜菜蔗糖代谢相关酶活性与糖积累关系的研究［J］. 作物杂志， 2009， 3：27-31.

（责任编辑 马鑫）

Correlations Between Sucrose Accumulation and Activities of SPS，SS at Processing M aturing Stage of Sugarcane

Niu Junqi1Huang Jingli1Zhao Wenhui1Yang Litao1，2Li Yangrui1，2
（1. Agricultural College，Guangxi University State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Nanning 530005；2. Sugarcane Research Center，Chinese Academy of Agricultural SciencesSugarcane Research Center，Guangxi Academy of Agricultural SciencesKey Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement（Guangxi），Ministry of AgricultureGuangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement，Nanning530007）

The correlations between sucrose accumulation and activities of 3 enzymes viz， sucrose phosphate synthase（SPS）， sucrose synthase in the synthesis direction（SS-s）， and sucrose synthase in the cleavage direction（SS-c）were studied using the leaf+1 and 7 internodes of early-maturing cultivar GT28 and early-intermediate-maturing cultivar ROC22 at processing maturing stage of sugarcane. The results indicated that the activities of SPS， SS-s and SS-c in the leaf+1 were higher than those in stalks of both GT28 and ROC22， suggesting that the leaf+1 was vigorous and active for physiological metabolism， which was the substantial basis for continuous sucrose accumulation in stalks. The SPS activity in internode was significantly and positively correlated with the brix， total soluble sugar and sucrose content of internode， and it was higher in GT28 than in ROC22. Meanwhile， SS-s activity was significantly and negatively correlated with the brix and sucrose content in internode， and it was lower in GT28 than in ROC22. However， SS-c was significantly and negatively correlated with brix， total soluble sugar and sucrose content in the internode of ROC22， while positively in GT28 although it was not significant statistically. This suggests that SPS and SS-s activities promote the sucrose accumulation in the immature internodes；with the internode maturing， sucrose content might be an important regulatory factor to convert the SS activity from synthesis to cleavage direction.

sugarcane；sucrose phosphate synthase；sucrose synthase；sucrose accumulation；correlation analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.014

2015-01-16

国家“863”计划课题（2013AA102604），广西自然科学基金项目（2011GXNSFF018002，2013NXNSFAA019073），国家国际合作项目（2009DFA30820，2013DFA31600），广西八桂学者和特聘专家专项经费资助（2013）

作则介绍：牛俊奇，男，博士研究生，研究方向：甘蔗生理和分子生物学；E-mail：niujunqi3218@163.com

杨丽涛，女，博士，教授，研究方向：甘蔗生理生化和病虫害研究；E-mail：liyr@gxu.edu.cn李杨瑞，男，博士，教授，研究方向：甘蔗育种和生物固氮研究；E-mail：liyr@gxaas.net