玉米花粉粗多糖及级分体外抗氧化效果的比较

李云捷，汤尚文，郭壮，余海忠

（湖北文理学院化学工程与食品科学学院，湖北襄阳441053）

玉米花粉粗多糖及级分体外抗氧化效果的比较

李云捷，汤尚文，郭壮，余海忠

（湖北文理学院化学工程与食品科学学院，湖北襄阳441053）

通过对小鼠组织及体液的体外试验，研究不同体系中玉米花粉粗多糖及级分的体外抗氧化活性，并进行比较。结果表明，玉米花粉粗多糖及级分可抑制小鼠肝组织的脂质过氧化，对Fe2+和H2O2诱导的肝组织过氧化物损伤具有保护作用，能减轻线粒体肿胀和减少红细胞溶血的发生，且其效果具有随用量的增加呈递增趋势。经比较，玉米花粉粗多糖在以上作用中显示出比其它玉米花粉多糖级分更好的效果。

玉米花粉粗多糖；玉米花粉多糖级分；体外抗氧化

蜂花粉是指蜜蜂采蜜时带回的花粉团，在蜂巢内经过储藏和发酵后形成的花粉。它富含人体所需的各种营养素，且研究表明，其具有抗氧化、延缓衰老、提高免疫力等作用［1］。玉米自16世纪传入我国，至今已有470多年的栽培历史，目前，我国玉米产量位居世界第二。玉米主要通过蜜蜂授粉，简称玉米花粉。如按照2005年全国玉米种植面积3.9亿亩计算，玉米花粉亩产量平均为18.3 kg，共可采集玉米花粉713.7万t［2］。充分利用好该资源，必将产生显著的经济效益和社会效益。

研究显示，玉米花粉多糖的含量是蜂花粉类中最高的，具有抗肿瘤效用、对巨噬细胞的具有一定的激活作用［3］。但其抗氧化的活性报道较少。本文从亚细胞器、组织及动物体水平上评价了玉米花粉粗多糖及其级分的抗氧化作用，并比较了不同玉米花粉多糖级分之间的抗氧化活性大小，以期为玉米花粉多糖功能食品的开发利用提供理论参考。

1材料与方法

1.1材料

试验样品采用水提醇沉法，得到玉米花粉粗多糖CPP（Corn pollen polysaccharide，以下简称CPP）；CPP经savag法脱蛋白后，并分别用体积分数分别为50%、60%、75%的乙醇分级，得到级分FCPP-A（fraction-A from Corn pollen polysaccharide以下简称FCPP-A）、FCPP-B（fraction-B from Corn pollen polysaccharide以下简称FCPP-B）、FCPP-C（fraction-C from Corn pollen polysaccharide以下简称FCPP-C）［4］。

试验动物：昆明种小鼠，雄性，体重（20±2）g。由湖北省医学动物试验中心提供。

1.2试剂及仪器

1.2.1主要试剂

牛血清白蛋白（生物试剂）：北京双旋微生物培养基制品厂；MDA及活性氧测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；VC、硫酸亚铁及其它均为国产分析纯。

1.2.2主要仪器

UV-265FW型紫外可见分光光度计：Shimadzu Co. Japan；AC210S型电子天平：SartoriusGermany；A1930049型电子恒温水浴锅：上海医疗器械五厂；DGT-G500-X型干燥箱：重庆试验设备厂一分厂；CT15RE低温超速离心机：Htachi，Japan。

1.3方法

1.3.1对小鼠红细胞自氧化溶血时的丙二醛（MDA）生成的影响

昆明种小鼠20只，雄性，体重（20±2）g，眼球取血，肝素抗凝，3 000 r/min离心分离得红细胞，冷生理盐水洗涤3次，制成0.5%悬浮液，取红细胞（Red Blood Cell，下简称RBC）悬浮液5.0 mL与0.2 mL一定浓度样品液混合，并于37℃温育24 h（对照管以0.2 mL蒸馏水替代样品液）。用生理盐水稀释5倍，3 000 r/min离心10 min。取上清液按试剂盒操作步骤进行试验，以蒸馏水做空白，测红细胞溶血时丙二醛的生成量，以吸光度表示丙二醛生成的量。

1.3.2对小鼠肝组织匀浆丙二醛（MDA）生成的影响

制备10%的小鼠肝组织匀浆液［5-6］。按MDA测定试剂盒方法测定并计算MDA含量，并计算抑制率。肝匀浆蛋白质含量用Lowry法测定，以牛血清白蛋白为标准。FeSO4诱导组和H2O2诱导组按文献［7-8］方法处理。

式中：A0为空白；A1为样品。

1.3.3对小鼠肝线粒体肿胀度的影响

取10%的肝组织匀浆液5 mL，先以3 000 r/min离心10 min，弃去沉淀，取上清液以10 000 r/min离心10 min，所得的沉淀即为线粒体［9-10］，用Lowry法测定该悬浮液的蛋白质含量，调整成蛋白质浓度为0.5 mg/mL的线粒体悬液，在试管中加入不同浓度的样品液0.4mL。空白加生理盐水，再加入3.0 mL线粒体悬液和1.4 mL 0.5 mmol/L的FeSO4溶液及0.4 mL 0.5 mmol/L VC溶液，迅速混匀后于520 nm处比色测定吸光度，吸光度降低表示线粒体发生肿胀。抑制率计算方法同1.3.2。

1.3.4对小鼠肝线粒体脂质过氧化的影响

在试管中加入1.0 mL线粒体悬液（蛋白质含量0.5 mg/L），0.4 mL样品液，0.4 mL 0.5mmol/L的硫酸亚铁溶液和0.4 mL 0.5 mmol/L的VC溶液，空白以生理盐水代替样品溶液，混匀后于37℃温浴1 h后，按照试剂盒的方法测定MDA的生成量，并计算抑制率。抑制率计算方法同1.3.2。

2结果及分析

2.1玉米花粉粗多糖及级分对小鼠红细胞自氧化溶血时丙二醛（MDA）生成的影响

玉米花粉粗多糖及级分对RBC溶血时MDA产生的影响如图1所示。

图1　玉米花粉粗多糖及级分对小鼠红细胞自氧化溶血时MDA生成的影响Fig.1Eeffct of CPP on MDA formation during the hemolysis of rat RBC

在试验剂量范围内，玉米花粉粗多糖及级分对MDA的生成均有一定程度的抑制作用，表明玉米花粉多糖及级分对红细胞自氧化溶血的保护作用与其抑制红细胞膜的脂质过氧化反应有一定的关联。

2.2玉米花粉粗多糖及对小鼠肝匀浆自发性生成MDA的影响

玉米花粉粗多糖及级分对小鼠肝匀浆自发性生成MDA的影响及量效关系分别见表1和表2。

表1　玉米花粉粗多糖及级分对小鼠肝匀浆自发性生成MDA的影响Table 1Effects of CPP on MDA formation of rat liver incubated in vitro（n=3，±s）

表1　玉米花粉粗多糖及级分对小鼠肝匀浆自发性生成MDA的影响Table 1Effects of CPP on MDA formation of rat liver incubated in vitro（n=3，±s）

注：a为与空白比较误差在P＜0.01以内；b为与空白比较误差在P＜0.05以内；—为0。

试样浓度/（μg/mL）MDA吸光值（A540）抑制率/% CPP1250.280±0.005a16.67 2500.246±0.004a24.79 5000.234±0.005a32.36 1 0000.180±0.005a46.43 FCPP-A1250.294±0.004a12.5 2500.284±0.007a17.48 5000.184±0.004a40.24 1 0000.162±0.011a51.79 FCPP-B1250.280±0.007a16.67 2500.268±0.006a24.24 5000.204±0.006a39.29 1 0000.186±0.004a44.64 FCPP-C1250.312±0.004a7.14 2500.286±0.003a14.88 5000.232±0.004a30.95 1 0000.214±0.006a36.31 Control00.336±0.002a—

由表1所示，玉米花粉多糖各级分FCPP-A、FCPP-B、FCPP-C及粗多糖CPP对肝匀浆MDA的生成均有较好的抑制作用，且随着浓度的加大而增大。其中，CPP和FCPP-A的效果最好。说明玉米花粉粗多糖及级分可通过对自由基产生的抑制作用来抑制肝组织自氧化，从而达到保护肝组织的目的，但不一定纯度越高，效果越好。

表2　玉米花粉粗多糖及级分对抑制小鼠肝匀浆自发性生成MDA的量效关系Table 2The relationship of CPP on MDA formation of rat liver incubated

线形回归（见表2）分析表明，FCPP-A、FCPP-B、FCPP-C及粗多糖CPP对小鼠肝匀浆自发性生成MDA的抑制效果与它们的浓度符合一元二次方程模型，其相关系数r2分别是：0.992 4、0.977 5、0.996 2和0.995 1。

2.3玉米花粉粗多糖及级分对诱导小鼠肝匀浆生成MDA的影响

玉米花粉粗多糖及对Fe2+和H2O2诱导小鼠肝匀浆生成MDA的影响见表3。

表3　玉米花粉粗多糖及对Fe2+和H2O2诱导小鼠肝匀浆生成MDA的影响Table 3Effects of CPP on MDA formation of rat liver induced by Fe2+and H2O2in vitro（n=3，±s）

表3　玉米花粉粗多糖及对Fe2+和H2O2诱导小鼠肝匀浆生成MDA的影响Table 3Effects of CPP on MDA formation of rat liver induced by Fe2+and H2O2in vitro（n=3，±s）

抑制率/% CPP630.919±0.026b23.410.682±0.001a18.42 1250.840±0.014b30.060.672±0.008a19.62 2500.830±0.001a30.890.658±0.001a21.29 5000.795±0.021b33.810.650±0.001a22.25 1 0000.775±0.035b35.470.624±0.018b25.36 FCPP-A631.01±0.014a15.900.760±0.035b9.09 1250.990±0.028b17.570.714±0.010a14.59 2500.930±0.028b22.560.708±0.006a15.31 5000.840±0.014b30.060.684±0.011a18.18 1 0000.830±0.001a30.890.654±0.004a21.77 FCPP-B631.025±0.021b14.650.754±0.004a9.81 1250.990±0.014b17.570.750±0.004a10.29 2500.975±0.007a18.820.648±0.008a22.49 5000.945±0.007a21.320.640±0.007a23.44样品浓度/（μg/mL）Fe2+-诱导H2O2-诱导MDA吸光值（A540）抑制率/% MDA吸光值（A540）

续表3玉米花粉粗多糖及对Fe2+和H2O2诱导小鼠肝匀浆生成MDA的影响Continue table 3Effects of CPP on MDA formation of rat liver induced by Fe2+and H2O2in vitro（n=3，±s）

续表3玉米花粉粗多糖及对Fe2+和H2O2诱导小鼠肝匀浆生成MDA的影响Continue table 3Effects of CPP on MDA formation of rat liver induced by Fe2+and H2O2in vitro（n=3，±s）

注：a为与空白比较误差在P＜0.01以内；b为与空白比较误差在P＜0.05以内；—为0。

抑制率/% 1 0000.845±0.007a29.640.622±0.009a25.60 FCPP-C631.025±0.007a14.650.710±0.001a15.07 1251.010±0.014a15.900.694±0.003a16.99 2500.960±0.042b20.070.680±0.007a18.66 5000.925±0.007a22.980.664±0.004a20.57 1 0000.905±0.021b24.650.630±0.028b24.64 control01.201±0.007—0.836±0.003—样品浓度/（μg/mL）Fe2+-诱导H2O2-诱导MDA吸光值（A540）抑制率/% MDA吸光值（A540）

亚铁离子和双氧水是很强的自由基诱导剂，可见在小鼠肝匀浆中添加自由基诱导剂后其自氧化产生的MDA显著增加。如表3所示，在这两种体系内，玉米花粉粗多糖及级分均表现出一定的抑制MDA生成活性。其中，二者表现均最佳的是CPP。

2.4玉米花粉粗多糖及级分对诱导小鼠肝线粒体肿胀度的影响

玉米花粉粗多糖及级分对Fe2++VC诱导小鼠肝线粒体肿胀度的影响见表4。

表4　玉米花粉粗多糖及级分对Fe2++VC诱导小鼠肝线粒体肿胀度的影响Table 4Effects of CPP on mitochondria swelling induced by Fe2++ VC（n=3±s）

表4　玉米花粉粗多糖及级分对Fe2++VC诱导小鼠肝线粒体肿胀度的影响Table 4Effects of CPP on mitochondria swelling induced by Fe2++ VC（n=3±s）

注：a为与空白比较误差在P＜0.01以内；b为与空白比较误差在P＜0.05以内；—为0。

试样时间/min抑制率/% 0102040 Control0.278± 0.001 0.249± 0.001 0.240± 0.001 0.236± 0.002—CPP0.302± 0.006a0.301± 0.001a0.284± 0.003a0.276± 0.003a43.02 FCPP-A0.312± 0.001a0.304± 0.003a0.290± 0.005a0.278± 0.001a27.86 FCPP-B0.316± 0.004a0.312± 0.002a0.289± 0.001a0.282± 0.002a28.79 FCPP-C0.314± 0.004a0.306± 0.008a0.284± 0.003a0.276± 0.003a19.92

脂质过氧化会使膜的通透性增加，引起膜内外物质的外泻或内流，造成如线粒体肿胀等现象的发生，加入抗坏血酸和硫酸亚铁可以诱导产生羟基自由基，直接与线粒体膜上的多不饱和脂肪酸发生过氧化反应，改变膜的流动性和通透性，引起线粒体肿胀或破坏其膜结构的完整。不同玉米花粉粗多糖及级分对诱导小鼠肝线粒体肿胀度的影响大小依次为粗多糖CPP、FCPP-B、FCPP-A、FCPP-C。

2.5玉米花粉粗多糖及级分对小鼠肝线粒体脂质过氧化的影响

玉米花粉粗多糖及对小鼠肝线粒体脂质过氧化的影响见表5。

表5　玉米花粉粗多糖及对小鼠肝线粒体脂质过氧化的影响Table 5Effects of CPP on lipid peroxidation of rat liver mitochondria（n=3，±s）

表5　玉米花粉粗多糖及对小鼠肝线粒体脂质过氧化的影响Table 5Effects of CPP on lipid peroxidation of rat liver mitochondria（n=3，±s）

注：a为与空白比较误差在P＜0.01以内；b为与空白比较误差在P＜0.05以内；—为0。

试样浓度/（μg/mL）MDA吸光值（A540）抑制率/% CPP1250.265±0.008a44.33 2500.237±0.018a50.21 5000.214±0.006a55.04 FCPP-A1250.248±0.007a47.90 2500.225±0.006a52.73 5000.212±0.003a55.46 FCPP-B1250.241±0.007a49.37 2500.228±0.008a52.10 5000.209±0.007a56.09 FCPP-C1250.267±0.029ab43.91 2500.213±0.005a55.25 5000.206±0.004a56.72 Control00.476±0.013—

由抗坏血酸和硫酸亚铁诱导引起线粒体膜脂质过氧化产生MDA，这一过程中由于线粒体膜上的多不饱和脂肪酸过氧化，会伴随造成线粒体膜结构破坏，检测MDA含量的变化可以间接反应线粒体膜脂质过氧化反应和膜被破坏的程度。如表5所示，FCPP-A、FCPP-B、FCPP-C及粗多糖CPP可显著抑制肝线粒体MDA的生成，且其抑制率随着浓度的增大而增加。在125 μg/mL～500 μg/mL的剂量范围里，不同玉米花粉粗多糖及级分对小鼠肝线粒体脂质过氧化的抑制活性大小依次为FCPP-C、FCPP-B、FCPP-A、及粗多糖CPP。

3结论

1）本研究表明玉米花粉粗多糖及级分对各种活性氧均有抗氧化作用，这表明玉米花粉粗多糖及级分具有直接清除自由基及脂质过氧化的活性，这为进一步研究其保健功效，探讨其作用机理奠定了基础。

2）从效果来看，玉米花粉粗多糖及级分对脂质抗氧化作用随用量的增加呈递增趋势。其中，粗多糖CPP在对小鼠红细胞自氧化溶血时对MDA的抑制作用、对小鼠肝匀浆自发性及诱导性产生MDA的抑制作用及对诱导小鼠肝线粒体肿胀度的抑制作用显示出比其它玉米花粉粗多糖及级分更好的效果，可能是由于CPP中含有多糖与蛋白结合形成的糖蛋白结构共同作用的结果，有待于进一步研究。

3）玉米花粉多糖抗氧化的机理尚待研究，其对脂质抗氧化的作用与多糖的结构关系仍不明确。因此，从分子水平上阐明其结构与抗氧化作用之间的关系将成为下一步深入研究的重点。

［1］王开发.花粉的功能与运用［M］.北京:化学工业出版社，2004:1-20

［2］杨虎.20世纪中国玉米种业发展研究［D］.南京:南京农业大学，2011:6

［3］赵昌辉，李泳财，何东，等.玉米花粉成分、功能及其应用的研究［J］.食品工业科技，2010（9）:414-416

［4］李云捷，吴谋成，邓家庆，等.玉米花粉多糖的提取与结构的研究［J］.食品工业科技，2009（12）:93-94

［5］Xue Z H，Wu M C，Yin J Z．Technological optimizatation forhydrolysis of rapeseed albumin with alcalase［J］．Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering，2003，19（5）:176-l81

［6］汪艳，吴曙光，徐继红，等．米糠多糖与环磷酰胺联合抗肿瘤作用的免疫药理学机制研究［J］．解放军药学学报，2001，17（6）:291-294

［7］张尔贤，俞丽君，周意琳，等．Fe2+诱发脂蛋白PUFA过氧化体系及对若干天然产物抗氧化作用的评价［J］．生物化学与生物物理学报，1996，28（2）:218-222

［8］黄晓兰，阎俊，吴晓曼，等．枸杞多糖对H2O2诱导的小鼠生殖细胞损伤的影响［J］．食品科学，2003，24（12）:116-118

［9］游育红，林志彬．灵芝多糖肽的抗氧化作用［J］．药学学报，2003，38（2）:85-88

［10］Srigiridhar K，Nair K M，Subramanian R，et al．Oralrepletion of iron induces free radical mediated alterations in the gastrointestinal tract of rat［J］．Molecular and Cellular Biochemistry，2001，219（3）:91-98

The Comparison of the Vitro Anti-oxidative Effect from Corn Pollen Polysaccharide and Fractions

LI Yun-jie，TANG Shang-wen，GUO Zhuang，YU Hai-zhong
（College of Chemical Engineering and Food Science，Hubei University of Arts and Science，Xiangyang 441053，Hubei，China）

Through the vitro tests to the organization and body fluids of mice，the vitro antioxidant activity of different systems of corn pollen polysaccharide and fractions had been researched.The results showed that CPP and fractions could restrain the mouse liver tissue lipid peroxidation，and protect the liver tissue peroxide which was damaged by Fe2+and H2O2.It also could reduce mitochondria swelling.And those effects were increased with the increase of dosage of degrees.By comparison，corn pollen polysaccharide in the above role showed better results than other fractions from corn pollen polysaccharide.

corn pollen polysaccharide；fractions from corn pollen polysaccharide；vitro antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.003

2014-07-25

李云捷（1979—），女（汉），副教授，硕士，主要从事食品化学和功能食品的教学与研究。