伴皮肤鳞状细胞癌的角膜炎-鱼鳞病-耳聋综合征一例GJB2基因突变研究并文献复习

李智铭 刘晶晶 张学奇 宣暄 张谊 林孝华 徐云升 李秉煦

·研究报道·

伴皮肤鳞状细胞癌的角膜炎-鱼鳞病-耳聋综合征一例GJB2基因突变研究并文献复习

李智铭 刘晶晶 张学奇 宣暄 张谊 林孝华 徐云升 李秉煦

目的以GJB2基因为候选基因，研究1例伴有皮肤鳞状细胞癌的角膜炎-鱼鳞病-耳聋综合征患者的分子病因。方法收集1例伴有皮肤鳞状细胞癌的角膜炎-鱼鳞病-耳聋综合征患者临床资料，提取患者及其父母的外周血DNA，用PCR扩增GJB2基因的第2外显子后直接测序，检测患者GJB2基因的突变情况。结果患者GJB2基因中核苷酸序列外显子2第148位碱基由G突变为A（c.148G＞A），此突变导致GJB2基因第50位氨基酸密码子由GAC替换为AAC，其编码的连接蛋白Cx26第50位天冬氨酸转换成天冬酰胺（p.Asp50Asn）。此外，GJB2基因外显子2第79位碱基由G突变为A（c.79G＞A），突变导致连接蛋白Cx26第27位的缬氨酸转换成异亮氨酸（p.Val27Ile）。患者的父母未检测到GJB2基因突变位点。文献检索发现国外已有13例角膜炎-鱼鳞病-耳聋综合征伴皮肤黏膜鳞状细胞癌的病例报道，经过基因测序确诊的7例患者均为GJB2基因c.148G＞A突变。结论GJB2基因突变可能是导致本例角膜炎-鱼鳞病-耳聋综合征临床表型的致病原因，c.148G＞A突变位置可能与皮肤鳞状细胞癌发生有关。

突变；癌，鳞状细胞；GJB2基因；角膜炎-鱼鳞病-耳聋综合征

角膜炎-鱼鳞病-耳聋综合征（Keratitis-ichthyosisdeafness syndrome,KID综合征）（OMIM 148210）是一种罕见的外胚层发育缺陷性疾病，主要表现为广泛性鱼鳞病样皮损、角膜血管形成、感音神经性耳聋以及伴发稀毛症、局部少汗、甲营养不良等特征。2002年，Richard等［1］将其致病基因确定在编码缝隙连接蛋白Cx26的GJB2基因上。本文报道1例伴有皮肤鳞状细胞癌的KID综合征患者临床特征和基因突变研究，并复习相关文献。

一、病例资料

患者女，36岁，汉族，已婚，农民。出生时全身弥漫性潮红，毛发缺如，数日后皮肤干燥、脱屑、增厚。曾在北京协和医院诊断为鱼鳞病，未予以治疗。皮肤粗燥、增厚，随年龄增加而加重。2岁时发现有耳聋。5岁时自觉视力下降，伴双眼干涩、畏光、流泪等症状。5年前左下肢出现溃烂，逐渐增大。患者为足月顺产，家族中无类似疾病患者。体检：全身皮肤弥漫性过度角化，粗糙、干燥，呈皮革样变化（图1），指、趾甲板增厚，甲沟处可见脱落的粗糙角质物，头发、眉毛完全脱失，无腋毛及阴毛。口周、眼周皮肤过度角化，形成放射状和环状沟纹。左下肢可见一个直径10 cm×12 cm大小斑块，覆有黄色痂屑。耳科检查：双耳重度先天性感音神经性聋。眼部检查：右眼裸眼视力为0.1，左眼为眼前手动；双眼睑球结膜混合充血++，角膜血管增生，伴角膜混浊。妇科检查：子宫增大如孕2月，右前壁可触及直径7 cm大小的肿瘤。实验室检查：血尿粪常规、生化全套、免疫球蛋白、补体均正常。快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）阴性，抗HCV抗体、抗HIV抗体阴性。X线胸片、心电图检查无异常。B超：子宫肌瘤、宫内节育器。皮肤活检：①腹部皮肤：皮肤鳞状上皮角化过度伴角化不全，颗粒层减少，棘细胞层肥厚，真皮血管周围少数炎症细胞浸润；②左下肢斑块：非典型鳞状细胞呈团块状向下生长，突破基底膜带并侵入真皮组织，肿瘤细胞核大小不一，染色质丰富，可见核分裂相，肿瘤组织周围可见大量的炎性细胞浸润，大多为淋巴细胞、嗜中性粒细胞和组织细胞。根据典型的临床特征及组织病理检查，确诊为伴皮肤鳞状细胞癌的KID综合征。

作者单位：325000温州医科大学附属第一医院皮肤科

图1 患者全身皮损表现 1A：腹部皮肤呈皮革样变化；1B：指甲板增厚；1C：头发、眉毛脱失；1D：左下肢巨大斑块，覆有黄色痂屑

二、基因突变检测和突变功能预测

1．外周血DNA提取：采集患者及其父母的外周静脉血各2 ml，同时取50例健康人静脉血作为对照，用EDTA二钾盐抗凝。使用QIAGEN试剂盒抽提基因组DNA，按照实验步骤进行。

2．PCR扩增：GJB2基因的编码区位于第2外显子，设计引物为5′-CATCTTATCCTCAC GGTTCT-3′和 5′-TTGTGGCATCTGGAGTTTC A-3′，扩增片段94 bp，扩增产物覆盖全部编码区。同时扩增50例健康人的GJB2基因第2外显子。PCR扩增反应所需的引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。扩增条件：94℃预变性 5 min；94℃变性 30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 45 s，30个循环；72℃后延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

3．DNA测序及突变分析：PCR产物经纯化后直接采用ABI 3730XL测序仪（美国ABI公司）测序，测序结果采用Chromas软件（版本2.0）对基因序列进行对比分析，确定突变位点。

4．基因测序结果：见图2。根据患者的GJB2基因测序结果确定了2个突变，外显子2在148位的碱基G被A置换（c.148G＞A），此突变导致GJB2基因第50位氨基酸密码子由GAC替换为AAC，其编码的氨基酸由天冬氨酸替换为天冬酰胺（p.Asp50Asn）。而c.79G＞A突变导致其编码的连接蛋白Cx26第27位的缬氨酸转换成异亮氨酸（p.Val27Ile）。突变由反向测序得到验证。该突变在患者父母及50例健康人对照中均未检测到。由于本研究发现的GJB2基因为错义突变，采用Polyphen-2软件进行生物信息学分析，预测GJB2基因p.Asp50Asn突变可能导致的表型效应为“probably damaging”，其预测值为0.994。p.Val27Ile突变可能导致的表型效应也为“probably damaging”，其预测值0.996。

图2 患者GJB2基因存在杂合突变，外显子2的第148位碱基G被A置换，第79位碱基G被A置换，患者父母及健康对照组中均未检测到该突变

三、讨论

编码缝隙连接蛋白Cx26的GJB2基因突变是KID综合征的致病基础。GJB2基因全长4 804 bp，含2个外显子，编码区位于第2外显子。Cx26蛋白是一种β连接蛋白，由4个跨膜的螺旋区域（M1、M2、M3、M4）、2 个细胞外环（E1、E2）和1个细胞内环（CL）组成，其N-末端及C-末端皆在膜的细胞质侧［2］。GJB2基因表达于外胚层来源的组织中，特别是在人类的皮肤组织和耳蜗。目前报道引起KID综合征的GJB2基因突变均为错义突变，突变后蛋白改变的区域主要集中在N-末端和细胞外环上［3-7］。本例KID综合征患者的GJB2基因突变（p.Asp50Asn）位于Cx26蛋白第一个细胞外环上。区域内突变可影响单通道的传导性以及半通道的开放频率，并进一步引起半通道的内流增加。多个研究表明，细胞膜上连接蛋白半通道活性增加是KID综合征发病的病理生理基础［8-11］。

KID综合征的临床表现除与GJB2基因突变的位置相关外，还可能与种族背景有关。p.Gly45Glu，p.Ala88Val，p.Ser17Phe被认为与严重型KID综合征有关［5-7］，但在日本非综合征性耳聋患者p.Gly45Glu突变较为普遍，且未发现严重致死型的KID患者。包括本病例，目前国内4例经基因测序确诊的KID综合征病例均为Cx26基因突变C.148G＞A，突变导致其编码的连接蛋白Cx26第50位的天冬氨酸转换成天冬酰胺（p.Asp50Asn）［12-14］。该突变位于Cx26蛋白高度保守区域内，是GJB2基因最常见的突变，约占80%。此区域被认为与皮肤红斑角化性损害相关，突变导致缝隙连接半通道功能异常，从而影响了细胞间信号传递以及细胞的代谢和增殖等活动，最终导致疾病的发生［15］。

本病例除全身弥漫性过度角化、血管化角膜炎以及先天性感音神经性耳聋等典型KID临床特征外，尚伴有皮肤鳞状细胞癌。KID患者伴发鳞状细胞癌可能与GJB2基因突变的位置有关。检索文献发现，国外已有13例KID综合征伴鳞状细胞癌的病例报道，经过基因测序确诊的7例患者均为GJB2基因p.Asp50Asn突变，另外6例未进行基因测序分析［16-25］。但是并非所有的p.Asp50Asn突变患者伴有皮肤鳞状细胞癌。可见皮肤鳞状细胞癌的发生除与GJB2基因突变的位置有关外，可能还有一些其他因素参与，包括免疫功能缺陷、慢性刺激及皮肤感染等［25］。另外，本文研究的KID综合征病例除C.148G＞A杂合突变外，GJB2基因还存在c.79G＞A突变，导致连接蛋白Cx26第 27位的缬氨酸转换成异亮氨酸（p.Val27Ile），p.Val27Ile突变在日本人群中被认为是基因多态性突变，但我们在正常对照人群中未发现该突变。p.Val27Ile是否协同p.Asp50Asn突变导致KID综合征及皮肤鳞状细胞癌的发生？进一步的功能研究将有助于阐明该基因型与临床表型的关系。

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A case of keratitis-ichthyosis-deafness syndrome complicated by cutaneous squamous cell carcinoma:mutation analysis of the GJB2 gene and literature review

Li Zhiming,Liu Jingjing,Zhang Xueqi,Xuan Xuan,Zhang Yi,Lin Xiaohua,Xu Yunsheng,Li Bingxu.Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,Zhejiang,China

ObjectiveTo analyze mutations in the GJB2 gene in a Chinese patient with keratitis-ichthyosisdeafness（KID）syndrome complicated by cutaneous squamous cell carcinoma.MethodsClinical data were collected from a patient with KID syndrome complicated by cutaneous squamous cell carcinoma.Peripheral blood samples were obtained from the patient and her parents,and DNA was extracted from these blood samples.PCR was performed to amplify the exon 2 of the GJB2 gene followed by direct DNA sequencing.ResultsA mutation（c.148G＞A）was identified at position 148 in exon 2 of the GJB2 gene,which caused a codon change from GAC to AAC and resulted in the substitution of aspartate by asparagine at position 50 in the connexin26 （Cx26）protein （p.Asp50Asn）.Inaddition,anothermutation（c.79G＞A）,whichledtothesubstitutionofvalinebyisoleucineatcodon27inCx26 （p.Val27Ile）,was found at position 79 in exon 2 of the GJB2 gene.Neither of the two mutations was detected in the patient′s parents.Literature review revealed that 13 cases of KID syndrome complicated by cutaneous squamous cell carcinoma had been reported in abroad,and the mutation c.148G＞A was detected in the GJB2 gene in all the 7 cases finally diagnosed by gene sequencing.ConclusionGJB2 gene mutations may be responsible for the clinical phenotype of KID syndrome in this Chinese patient,and the mutation c.148G＞A may be related to the development of cutaneous squamous cell carcinoma.

Mutation;Carcinoma,squamous cell;GJB2 gene;Keratitis-ichthyosis-deafness syndrome

Li Zhiming,Email:zhi-mingli@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.12.009

国家自然科学基金（81272987）；浙江省自然科学基金（LY12H11011）；浙江省温州市科技计划项目（Y20140580）

李智铭，Email：zhi-mingli@163.com

2015-02-25）

（本文编辑：颜艳）