黑曲霉发酵韭菜籽产蛋白酶活力的工艺研究

孙　婕，尹国友，陶战霞，乔少萌

（河南城建学院生命科学与工程学院，河南平顶山467036）

黑曲霉发酵韭菜籽产蛋白酶活力的工艺研究

孙婕，尹国友，陶战霞，乔少萌

（河南城建学院生命科学与工程学院，河南平顶山467036）

为了充分利用韭菜籽中的蛋白质，本实验研究了黑曲霉液态发酵脱脂韭菜籽粉的不同发酵条件对蛋白酶活力的影响。以发酵液中的蛋白酶活力为指标，用单因素实验结合响应面实验探究了初始pH、接种量、脱脂韭菜籽粉浓度和发酵时间对蛋白酶活力的影响。最佳发酵条件为：初始pH为2.95，接种量10.0%，底物浓度7.00%，发酵时间72.0h。在最佳工艺条件下蛋白酶活力可达到280U/mL。

脱脂韭菜籽，黑曲霉，液态发酵，蛋白酶

韭菜籽是百合科植物韭菜（Allium tuberosumRott. L）成熟干燥后的种子，又名韭子［1］，色黑、扁卵圆、气辣，韭菜籽为我国传统中药品种，始载于《名医别录》，被列为中品［2］。胡国华等［3］通过大量的分析测定实验，表明韭菜籽中含有较高含量的脂肪（15.8%）、膳食纤维（18.2%）和粗蛋白（12.3%）。韭菜籽资源在我国十分丰富，产量占世界首位，因此对韭菜籽进行产业化开发与利用显得十分重要。

近年来蛋白酶由于其用途广泛，商业价值高，一直是开发和研究的热点。而微生物来源的蛋白酶具有生产周期短、生产成本低、易于管理控制、不受土地和季节限制等优点，因此，微生物蛋白酶已迅速发展成为主要的蛋白酶来源［4］。其中，黑曲霉是一种重要的工业发酵菌种。黑曲霉培养条件粗放，可产生多种活性较强的酶系，如CX酶、淀粉酶、酸性蛋白酶等［5］。在发酵过程中因为菌种的生长特性、营养条件以及蛋白酶提取等方面的影响，黑曲霉蛋白酶活力有时候比较低，因此对黑曲霉蛋白酶活特性的研究具有很大的现实意义。本实验以脱脂韭菜籽粉为底物，采用黑曲霉液态发酵，探究黑曲霉产蛋白酶活力的最优工艺，旨为今后在工业中充分利用发酵法提取韭菜籽中生物活性物质提供相应的工艺参数。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

黑曲霉河南城建学院实验室保存菌种（40988）；斜面培养基察氏培养基［6］；脱脂韭菜籽粉（蛋白含量31.48%）平顶山市农业科学院提供；福林酚试剂上海荔达生物科技有限公司；三氯乙酸（TCA） 天津市致远化学试剂有限公司；无水碳酸钠、盐酸均为分析纯，洛阳市化学试剂厂；干酪素、酪氨酸上海索莱宝生物科技有限公司。

FA1004B型电子天平、PHSJ-3F型pH计上海精密科学仪器有限公司；LDZX-C型立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂；HZQ-C型空气浴振荡器哈尔滨市东明医疗仪器厂；紫外可见光分光光度计北京谱析通用仪器有限责任公司；超净工作台苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；HWSZ8型电热恒温水浴锅上海一恒科技有限公司；FDC-1044型高速离心机科大创新股份有限公司中佳分公司。

1.2实验方法

1.2.1实验流程制备黑曲霉菌悬液、发酵培养基→培养基灭菌→菌悬液接种到发酵培养基中→液态发酵→离心取上清液→酶活测定。

1.2.2制备黑曲霉孢子悬液和发酵培养基取黑曲霉斜面一支，用10mL生理盐水分两次将菌苔洗下，充分振荡10min后制成孢子悬液。用血球计数板在显微镜下直接计数［7］。用生理盐水调整孢子悬液浓度为105个/mL即为所需孢子悬液。

发酵培养：脱脂韭菜籽粉溶液50mL/瓶，121℃灭菌20min后冷却至室温，按照一定比例接入孢子悬液，振荡培养。

1.2.3酪氨酸标准曲线的制作精确称取在105℃条件下烘至恒重的酪氨酸0.1000g，用1mol/L的盐酸使之溶解后定容至1000mL，即为100μg/mL酪氨酸溶液。取6支试管并依次编号，分别取100μg/mL酪氨酸溶液0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mL于试管中，各补充蒸馏水至1mL，接着分别加入5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液和1mL福林酚试剂，立即混匀，于40℃水浴保温20min，以酪氨酸浓度为0的溶液为对照，在680nm下测定OD值。以酪氨酸的浓度（μg/mL）为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线。在标准曲线上求得OD值为1时的酪氨酸微克数（μg），即为K值［8-10］。

1.2.4蛋白酶活力的测定采用张剑等［11］的方法，略有改动。取4支洁净试管且编号甲、乙、丙、丁后各加入粗酶液1mL，甲管为对照。在甲试管中加入2mL 0.4mol/L TCA，使酶失活。在这4支试管中分别加入1mL 2%酪蛋白溶液，迅速混匀后立即将4支试管40℃水浴保温10min。然后在乙、丙、丁中分别加入2mL 0.4mol/L TCA，混匀后4000r/min离心15min，除去沉淀的酶蛋白和酪蛋白，得到上清液A。取1mL上清液A，分别注入4支新试管中，各管加入5mL 0.4mol/L的碳酸钠溶液和1mL福林酚试剂，立即混匀，40℃水浴中保温20min。使用分光光度计测定OD680nm。蛋白酶活力计算公式如下：

其中：A—从标准曲线上查得的OD值；K—表示A=1时酪氨微克数；N—酶的稀释倍数；4—酶活力测定中液体总体积（1mL粗酶液+1mL酪氨酸溶液+2mL TCA）；10—酶反应时间（10min）；V—测定时取酶液的体积（1mL）。

酶活力单位的定义：菌种活力的测定以酪蛋白为底物，以在40℃、pH3.6条件下，1mL粗酶液酶解酪蛋白，每分钟产生的酪氨酸微克数为一个酶活力单位（U），单位为U/mL。

1.2.5单因素实验设计蛋白酶活力主要受到初始pH、接种量、脱脂韭菜籽粉浓度和发酵时间的影响。因此需要通过实验明确各个因素的影响程度［12］。

1.2.5.1初始pH对蛋白酶活力的影响称取7%（m/v）脱脂韭菜籽粉于锥形瓶中，加入蒸馏水，调pH［13］分别为2、3、4、5、6、7后121℃条件下灭菌20min，待冷却至室温时加入10%（v/v）菌悬液，混匀后30℃、200r/min振荡培养72h后发酵结束。发酵液4000r/min离心15min后取上清液，即为粗酶液。测定蛋白酶活力，考察初始pH对蛋白酶活力的影响［14］。

1.2.5.2接种量对蛋白酶活力的影响分别称取7%（m/v）脱脂韭菜籽粉于锥形瓶中，加入蒸馏水，调pH为6.0后121℃条件下灭菌20min，待冷却至室温时分别加入5%、10%、15%、20%、25%（v/v）孢子悬液［15］，混匀后30℃、200r/min振荡培养72h后发酵结束。发酵液4000r/min离心15min后取上清液，即为粗酶液。测定蛋白酶活力，考察接种量对蛋白酶活力的影响。

1.2.5.3脱脂韭菜籽粉浓度对蛋白酶活力的影响分别称取3%、5%、7%、9%、11%（m/v）脱脂韭菜籽粉于锥形瓶中，加入蒸馏水，调pH为6.0后121℃条件下灭菌20min，待冷却至室温时加入15%（v/v）孢子悬液，混匀后30℃、200r/min振荡培养72h后发酵结束。发酵液4000r/min离心15min后取上清液，即为粗酶液。测定蛋白酶活力，考察脱脂韭菜籽粉浓度对蛋白酶活力的影响。

1.2.5.4发酵时间对蛋白酶活力的影响称取5%（m/v）脱脂韭菜籽粉于锥形瓶中，加入蒸馏水，调pH为6.0后121℃条件下灭菌20min，待冷却至室温时加入15%（v/v）孢子悬液，混匀后30℃、200r/min振荡培养。发酵结束后4000r/min离心15min取上清液，即为粗酶液。每间隔24h测定蛋白酶活力，研究蛋白酶活力随时间的变化趋势［16］。

1.2.6响应面实验设计在单因素实验结果的基础上采用四因素三水平的Box-Behnken响应面分析实验［17-18］，以初始pH、接种量、脱脂韭菜籽粉浓度和发酵时间为自变量，以蛋白酶活力为响应值。实验的因素和水平的取值见表1，利用Design-Expert7.1软件程序分析各单因素对蛋白酶活力的影响，找出最佳条件。

表1　响应面分析法的因素与水平表Table 1　Factors and levels of response surface methodology

1.3数据处理

本实验中单因素实验数据统计及作图均采用Excel 2003软件，响应面分析部分运用Design-Expert软件程序进行数据统计和作图，所有实验重复5次。

2　结果与分析

2.1酪氨酸标准曲线

酪氨酸标准曲线如图1所示。酪氨酸浓度在0～50μg/mL范围内测定OD值，R2为0.9994，线性较好。当OD680nm=1时，K=95。

图1　酪氨酸标准曲线Fig.1　Calibration curve of tyrosine

2.2单因素对蛋白酶活力的影响

2.2.1初始pH对蛋白酶活力的影响初始pH对蛋白酶活力的影响结果如图2所示。

图2　初始pH对蛋白酶活力的影响Fig.2　Effect of initial pH on protease activity

由图2可知，当pH为3时酶活力达到最大值即464U/mL，pH在3～5范围内，酶活力大幅度降低，pH在5～7范围内酶活力降低的较缓慢。从微生物适宜生长环境来看，培养基初始pH对酶的合成有重大影响，因为pH会影响到细胞膜所带的电荷，引起细胞对营养物质吸收状况的变化，对细胞施加间接影响，改变某些化合物分子进入细胞的状况，从而促进或抑制微生物的生长［19］。综上所述，选择初始pH3为最佳的发酵条件。

2.2.2接种量对蛋白酶活力的影响接种量对蛋白酶活力的影响结果如图3所示。

由图3可知，接种量对黑曲霉发酵脱脂韭菜籽粉产蛋白酶的活力有着重要的影响。过小或过大的接种量均不利于发酵产酶。当接种量较小时（低于10%），前期菌体生长过慢，使发酵周期延长，产酶较少，酶活力较低；随着接种量的增大，酶活力也随之增大，当接种量为10%时，酶活达到最大值，即144U/mL。接种量较高时（高于10%），初期菌体生长迅速，营养物多用于细胞合成，使酶合成下降，酶活力逐渐降低［20］；再从经济方面考虑，接种量过大，增加成本。因此，最终确定接种量10%为最佳条件。

2.2.3脱脂韭菜籽粉浓度对蛋白酶活力的影响脱脂韭菜籽粉浓度对蛋白酶活力的影响结果如图4所示。

图3　接种量对蛋白酶活力的影响Fig.3　Effect of inoculation concentration on protease activity

图4　脱脂韭菜籽粉浓度对蛋白酶活力的影响Fig.4　Effect of defatted leek seeds concentration on protease activity

由图4可知，随着脱脂韭菜籽粉浓度的增大，蛋白酶活力也随之增加，当脱脂韭菜籽粉浓度为7%时，酶活力达到最大，即186U/mL。从微生物的生长特点来看，黑曲霉是好氧真菌，当脱脂韭菜籽粉浓度较小时，培养基中的营养物质少，不利于黑曲霉生长和产酶；当脱脂韭菜籽粉浓度增大时，酶活反而下降。这可能是由于脱脂韭菜籽粉含丰富的蛋白质，当其浓度过高时会造成的氮源过多的环境，使菌体生长过旺盛，黑曲霉生长产生的粘性物质使培养基黏度增大，容易导致溶氧不足，不利于水解酶类的积累，从而导致酶活下降［21］。因此，脱脂韭菜籽粉浓度为7%时是最佳的发酵条件。

2.2.4发酵时间对蛋白酶活力的影响发酵时间对蛋白酶活力的影响结果如图5所示。

由图5可知，前72h酶活力随发酵时间增加而增加，在发酵72h时酶活力达到最大，即384U/mL；发酵72h后酶活力下降。从黑曲霉生长规律来看，在开始阶段黑曲霉处于生长延滞期，生长较慢，酶活力较低；随着时间的延长黑曲霉大量繁殖，消耗底物的速度加快，产酶较多从而使酶活力增大；发酵后期，黑曲霉开始衰亡，产酶能力下降，酶活力也随之逐渐降低［22］。综上所述，发酵72h是最佳的发酵条件。

2.3响应面法优化结果和分析

2.3.1回归模型的优化根据单因素实验结果，采用响应面分析法进行设计，对初始pH（A），接种量（B），脱脂韭菜籽粉浓度（C），发酵时间（D）4因素3水平共27个实验点（3个中心点）的响应面分析实验，运用Design-Expert软件程序对实验点的响应值进行回归分析。Box-Behnken实验设计和结果以及回归方程的方差分析结果见表2。

用Design-Expert 7.1软件，对表2中的数据进行多元回归拟合，可得回归方程为：

R1=+2.94-0.076A+0.034B+0.0005C-0.027D+ 0.065AB+0.070AC-0.0007AD-0.060BD-0.048CD-0.80A2-0.35B2-0.37C2-0.38D2

对回归方程进行方差分析，结果见表3。

图5　发酵时间对蛋白酶活力的影响Fig.5　Effect of fermentation time on protease activity

表2　Box-Behnken设计方案及响应值结果Table 2　Experiment design and results of response surface methodology

表3　回归方程的分析Table 3　Analysis of the established regression mode

由表3回归模型方差分析结果可知，模型的F值为170.6，p＜0.0001，表明模型极显著。回归方程的相关系数R2=0.9950，说明回归方程的拟合程度良好。模型调整确定系数R2Adj=0.9892，说明模型能解释98.92%响应值的变化，拟合程度较好。失拟项不显著（p＞0.05）说明数据中没有异常点，不需要引入更高次数的项，模型适当，能很好地对响应值进行预测。由表3和图6可以看出，一次项A及二次项A2、B2、C2、D2表现为极显著（p≤0.01），一次项B、D及交互项AB、AC、BD、CD表现为显著（p＜0.05），表明所考察因素对响应值的影响不是简单的的线性关系，曲面效应显著。影响蛋白酶活力的因素由大到小的顺序为：初始pH＞接种量＞发酵时间＞脱脂韭菜籽粉浓度。

响应面图形是响应值对应于实验因素A（初始pH）、B（接种量）、C（脱脂韭菜籽粉浓度）、D（发酵时间）所构成的三维空间的曲面图，它可直观反映各因素及它们之间的交互作用对响应值的影响。将一个因素固定在零水平，利用Design-Expert软件即可作出另外两因素交互作用的响应曲图。两因素及其交互作用响应面图如图6所示。

图6　两因素及其交互作用响应面图

2.3.2最佳实验条件确定通过Design-Expert软件分析，可得最佳的发酵条件为：初始pH2.95，接种量为10.1%，脱脂韭菜籽粉浓度为7.00%，发酵时间为72.0h。在此条件下，蛋白酶活力的理论值可达294U/mL。

为了验证实验结果是否与真实情况一致，从实际考虑对模型预测结果进行修正后最佳的发酵条件为：初始pH为2.95，接种量为10.0%，脱脂韭菜籽粉浓度为7.00%，发酵时间为72.0h。在此条件下进行3次平行实验，得到蛋白酶活力为280U/mL。实际值与预测值非常接近，说明优化结果可靠。

3　结论

根据单因素的实验结果，通过Box-Behnken中心组合实验设计及响应面分析，得到具有很好拟合度的回归方程模型，该模型具有统计学意义，从而确定优化条件。最终的优化条件为：初始pH为2.95，接种量为10.0%，脱脂韭菜籽粉浓度为7.00%，发酵时间为72.0h，在此条件下蛋白酶活力可达到280U/mL。

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Study on the process of protease production by Aspergillus niger on leek seeds

SUN Jie，YIN Guo-you，TAO Zhan-xia，QIAO Shao-meng
（College of Life Science and Engineering，Henan University of Urban Construction，Pingdingshan 467036，China）

In order to take full of advantage of leek seeds protein，this paper studied the effects of different fermentation conditions on the protease activity of Aspergillus niger in defatted leek seeds.According to the index of the protease activity in the fermented liquid，this experiment explored the effects of initial pH，inoculum size，substrate concentration and fermentation time on protease activity using single factor experiment and response surface methodology（RSM）.The optimum process conditions were as follows：initial pH 2.95，inoculum size 10.0%，substrate concentration 7.00%and fermentation time 72.0h.Under this optional conditions，the protease activity reached 280U/mL.

defatted leek seeds；Aspergillus niger；liquid-state fermentation；protease activity

TS201.1

A

1002-0306（2015）14-0098-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.010

2014－10－20

孙婕（1976-），女，博士，副教授，研究方向：天然产物分离纯化及功能性质研究。

河南省科技计划重点科技攻关项目（132102210192）；河南省教育厅科学技术重点研究项目（14A550003）；与平顶山市农业科学院合作项目（20121220）。