酿酒酵母转氨酶Ⅰ基因的克隆及序列分析

刘晓蓉，郭丽琼，林俊芳，*，康林芝，徐晓炜，文源华，陈　　宾，黎颖茵

（1.华南农业大学食品生物技术研究所，华南农业大学食品学院，广东广州510640；2.广东轻工职业技术学院食品系，广东广州510300；3.广州市澳键丰泽生物科技有限公司，广东广州510760）

酿酒酵母转氨酶Ⅰ基因的克隆及序列分析

刘晓蓉1，2，郭丽琼1，林俊芳1，*，康林芝3，徐晓炜1，文源华1，陈宾1，黎颖茵1

（1.华南农业大学食品生物技术研究所，华南农业大学食品学院，广东广州510640；2.广东轻工职业技术学院食品系，广东广州510300；3.广州市澳键丰泽生物科技有限公司，广东广州510760）

利用酿酒酵母YT0801的总DNA为模板，采用PCR技术克隆出转氨酶I基因的DNA序列，利用生物信息学工具对其核酸序列和蛋白序列进行分析。测序结果表明DNA序列含有一个1503bp的开放阅读框，编码500个氨基酸，推测等电点为5.81，相对分子质量为56.2ku。同源性比对结果显示，该基因及推测的氨基酸序列与已报道的ARO8基因（GenBank Accession No：NM 001181067.1）的同源性均为100%。此外，对其理化性质、信号肽、疏水性、亲水性、二级结构和三级结构进行了分析。该基因的成功克隆，为其功能研究和生物合成2-苯乙醇提供了分子基础。

酿酒酵母，转氨酶I，基因克隆，序列分析

2-苯乙醇（2-phenylethanol，简称2-PE）是一种具有玫瑰香气的芳香醇［1］，在化妆品和食品等领域应用广泛。目前2-PE大多通过化学合成［2］，但原料毒性大，副产物难以除去［3］，人们倾向于生物合成。很多酵母能合成2-PE［4-10］，但产量低；以L-苯丙氨酸为唯一氮源，酵母可通过艾利希途径提高2-PE的产量，但高浓度的2-PE会抑制酵母生长。针对产物抑制问题进行了大量研究［11-13］，但酵母转化2-PE尚未能实现工业化生产。因而，人们迫切希望通过基因工程技术来生产2-PE或其前体物质。

酵母通过艾利希途径合成2-PE，是分别在转氨酶、苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶3种酶的作用下完成的。转氨酶能催化L-苯丙氨酸形成苯丙酮酸。目前已知转氨酶有芳香族氨基转氨酶Ⅰ和芳香族氨基转氨酶Ⅱ两种，分别由基因aro8和aro9编码［14］，芳香族氨基转氨酶Ⅰ是细胞内普遍存在的、主要的转氨酶［15］。而芳香族氨基转氨酶Ⅱ在正常生长过程中不存在，只有当aro8基因缺失时，才通过苯丙氨酸等芳香族氨基酸诱导产生。近年来，国内外已开展艾利希途径相关酶基因克隆及表达的研究［16-17］。本研究从酿酒酵母YT0801中克隆出转氨酶Ⅰ基因YT0801-aro8，并对该基因的结构与推导的蛋白质序列进行分析，旨为构建高产2-PE的转基因菌株奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YT0801菌株、大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α华南农业大学食品生物技术研究所保存；TaKaRa Ex Taq酶、T4 DNA连接酶、EcoRⅠ酶等购自大连宝生物工程有限公司；pGEM-T Easy克隆载体购自Promega公司；质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒等购自天根生化科技有限公司；常规试剂均为国产分析纯；PCR引物由上海捷瑞生物工程公司合成；测序由华大基因完成。

5417C微量离心机德国Eppendorf公司；CHB-100恒温金属浴杭州博日科技有限公司；PCR扩增仪德国Biometra公司；DYY-6C电泳仪北京市六一仪器厂；Bio-Rad凝胶成像系统美国Bio-Rad公司。

1.2培养基

LB培养基胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L（固体），121℃高压灭菌20min。抗性筛选时加入氨苄青霉素，终浓度为80mg/L。

YPD培养基酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，pH自然，琼脂粉20g/L（固体），121℃高压灭菌20min。

1.3实验方法

1.3.1酿酒酵母YT0801总DNA的提取收集过夜培养20h的酿酒酵母YT0801菌体，参照文献［18］，采用珠磨法提取总DNA。

1.3.2转氨酶Ⅰ基因YT0801-aro8的克隆

1.3.2.1引物的设计根据已报道的酿酒酵母S288c转氨酶Ⅰ基因序列（GenBankAccessionNo：NM_001181067.1），设计PCR扩增引物，上游引物aro8F：5’-ATGACTTTACCTGAATCAAAA-GACT-3’；下游引物aro8R：5’-CTATTTGGAAATACCAAATT CTTCG-3’。

许沁没有贸然去找葛局长，那样必定遭到拒绝。许沁找了玉敏，玉敏大包大揽地应下了。她之前答应过许沁，不能言而无信。玉敏表现出了一副成竹在胸的样子。

1.3.2.2转氨酶Ⅰ基因YT0801-aro8的PCR扩增以提取的总DNA为模板进行PCR扩增。反应体系为：10×Ex Taq Buffer（Mg2+Plus）5.0μL，dNTP Mixture（2.5mmol/L each）4μL，DNA模板3μL，引物aro8F（10μmol/L）和aro8R（10μmol/L）各2μL，TaKaRa Ex Taq（5U/μL）0.5μL，ddH2O 33.5μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min后，94℃变性45s，48℃退火45s，72℃延伸90s，33个循环，72℃延伸10min，结束反应。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.2.3PCR产物的回收、转化及重组质粒的鉴定采用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增中的目标条带，与pGEM-T Easy载体连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取蓝白斑筛选中获得的白色单菌落，提取质粒，并进行EcoRⅠ单酶切鉴定。将阳性重组质粒提交华大基因公司进行序列测定。

1.3.3转氨酶Ⅰ基因YT0801-aro8的序列分析登陆http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/网站，利用Blast对获得的核苷酸序列及推测的氨基酸序列进行比对。登陆http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov进行核酸序列比对，登陆http：//web.expasy.org/protparam/将氨基酸序列进行分子量、理论等电点、氨基酸组成、原子组成和半衰期等的预测；登陆http：//web.expasy.org/protscale/进行蛋白质亲水性和疏水性预测；登陆http：//www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/进行信号肽预测；登陆http：// services.cbib.u-bordeaux2.fr/pise/toppred.html进行跨膜分析；登陆https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html进行蛋白质二级结构预测；登陆http：//www.cbs.dtu.dk/services/蛋白质三级级结构预测。

2　结果与分析

2.1转氨酶Ⅰ基因YT0801-aro8的扩增

提取酿酒酵母YT0801的总DNA，以aro8F和aro8R为引物进行PCR扩增。通过凝胶电泳，得到的PCR产物为一条约1500bp的片段，结果如图1所示。其片段大小与预期相符，且扩增特异性好，纯度高。

图1　YT0801-aro8的PCR扩增电泳图Fig.1　Electrophoresis pattern PCR amplification of YT0801-aro8

2.2阳性克隆质粒的鉴定

2.3转氨酶Ⅰ基因YT0801-aro8基因序列分析

2.3.1理化性质预测与分析测序结果（GenBank Accession No：KC422723.1）见图3，克隆基因片段全长1503bp。经BLAST比对，该基因及推测的氨基酸序列与已报道的酿酒酵母S288c ARO8（GenBank Accession No：NM_001181067.1）的相似性均为100%。ORF查找结果表明，扩增基因片段的阅读框架长度为1503bp，其中A、G、T和C分别为438个（占29.14%）、298个（占19.83%）、436个（占29.01%）和331个（占22.02%）。共编码500个氨基酸残基。利用在线工具ProtScale Server计算此蛋白质，相对分子质量大小为56.2ku，理论等电点为5.81，其半衰期在体外哺乳动物网织红细胞为4.4h，在酵母体内半衰期大于20h，在大肠杆菌体内大于10 h。不稳定系数（instability index）为36.51，属于稳定蛋白。脂溶系数（Aliphatic index）为82.72，总平均疏水指数（Grand average of hydropathicity）为-0.371，表明其为亲水性蛋白。该氨基酸序列功能位点的预测由在线分析工具Predict Protein完成，预测结果显示其包含多个作用位点，如N-糖基化作用位点、蛋白激酶C磷酸化作用位点等。

2.3.2疏水性和亲水性预测与分析登陆http：//web. expasy.org/protscale/，分析此蛋白质的疏水性和亲水性，结果见图4，横坐标表示氨基酸残基的序号，纵坐标表示氨基酸残基的疏水/亲水特性。由图4可知，第274位的赖氨酸残基和275位的谷氨酰胺残基的亲水性最强，分值为-2.700；第41位的甘氨酸残基的疏水性最强，分值为1.844；该蛋白的亲水性氨基酸略多于疏水性氨基酸，可推测此酶是亲水性蛋白质。

图2　YT0801-aro8重组质粒的酶切鉴定Fig.2　Enzyme digestion identification of recombinant plasmid YT0801-aro8

图3　YT0801-aro8基因序列及推导的氨基酸序列Fig.3　Nucleotide sequences and its deduced amino acid sequence of YT0801-aro8 from Saccharomyces cerevisiae

图4　氨基酸序列亲水性和疏水性分析Fig.4　The hydrophilicity and hydrophobicity analysis of deduced amino acid sequence

2.3.3信号肽预测和分析利用在线网站iPSORT prediction预测信号肽定位。结果显示，该氨基酸序列不含信号肽或线粒体转运肽，为非分泌性蛋白，没有跨膜结构，这与2.3.2在线分析氨基酸序列亲疏水性相符。

2.3.4二级结构预测与分析此蛋白质的二级结构预测如图5所示，α-螺旋结构占37.4%，β-折叠占4.8%，延伸链和无规则卷曲分别占16.2%和41.6%。由此可知，此蛋白含有较多的α-螺旋和无规则卷曲，而延伸链和β-折叠则随机散布于整个蛋白中。

图5　蛋白质二级结构预测图谱Fig.5　The predicted map of target protein secondary structure

2.3.5三级结构预测与分析用SAM-T08［19］预测该蛋白质的三级结构，结果见图6。由图6可知，此蛋白具有明显的空间结构，主要由α螺旋和无规则卷曲构成，与NPS@的分析预测结果一致。

2.3.6多重序列比对采用DNAMAN version 5.2.2，将YT0801-aro8推测的氨基酸序列与GenBank中有关的转氨酶基因进行氨基酸多重序列比对。结果表明，它与其他微生物来源的转氨酶一级结构相似性差异较大；与Lachancea thermotolerans CBS 6340（GenBank Accession No：XP_002555128）相似性最大，为64.75%；与Colletotrichum fioriniae PJ7（XP_007602696）的相似性最小，为24.80%；与Talaromyces marneffei ATCC 18224（XP_002145224）及Togninia minima UCRPA7（XP_007913717）的相似性都是35.77%；与Candida albicansSC5314（XP_719544）、Aspergillusflavus NRRL3357（XP_002379696）及Eutypa lata UCREL1（XP_007799376）的相似性分别为51.69%、36.69%和32.93%。

图6　蛋白质三级结构预测图谱Fig.6　The predicted map of target protein three-dimensional structure

3　结论

以酿酒酵母YT0801基因组DNA为模板，采用PCR技术克隆出转氨酶I的DNA序列。该DNA的开放阅读框长为1503bp，编码500个氨基酸，与GenBank中酿酒酵母S288c（NM 001181067.1）ARO8基因的相似性为100%，但与其他7种微生物来源的转氨酶一级结构相似性差异较大。二级结构预测该酶由较多α-螺旋、β-折叠和少量延伸链、无规则卷曲构成，而三级结构主要由α螺旋和无规则卷曲构成，表明芳香族氨基转氨酶Ⅰ具有复杂的空间结构，对催化与苯丙氨酸相关的转氨反应具有重要作用。还通过生物信息学软件和在线分析网站，预测了该基因编码的氨基酸序列的功能位点及其他蛋白质属性。为下阶段利用所克隆的YT0801-aro8基因进行表达生产2-苯乙醇和中间产物奠定了分子基础。

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Cloning and sequence analysis of aromatic aminotransferaseⅠgene from Saccharomyces cerevisiae

LIU Xiao-rong1，2，GUO Li-qiong1，LIN Jun-fang1，*，KANG Lin-zhi3，XU Xiao-wei1，WEN Yuan-hua1，CHEN Bin1，LI Ying-yin1
（1.Institute of Food and Biotechnology，College of Food Science，South China Agriculture University，Guangzhou 510640，China；2.Department of Food，Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，China；3.Alchemy Biotechnology Co.Ltd.of Guangzhou City，Guangzhou 510760，China）

Total DNA from Saccharomyces cerevisiae YT0801 was used as the template to clone aromatic aminotransferaseⅠgene YT0801-aro8 by PCR amplification.Bioinformatics softwares were used to analyse the DNA and protein sequence.The result of DNA sequencing showed that the amplified YT0801-aro8 had an open reading frame of 1503bp，which coded 500 amino acid residues.The molecular mass was 56.2ku and the theoretical isoelectric point was 5.81.Blastn and Blastx alignment results demonstrated that both the nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of YT0801-aro8 exhibited 100%of similarities to ARO8（GenBank Accession number：NM 001181067.1）.Besides，the bioinformatics，including physical and chemical properties，the signal peptide，hydrophobicity，hydrophilicity，secondary structure and tertiary structure，were analyzed.The cloning of YT0801-aro8 could provide the molecular base for study of its functions and biosynthesizing 2-phenylethanol.

Saccharomyces cerevisiae；aromatic aminotransferaseⅠ；gene cloning；sequence analysis

TS201.1

A

1002-0306（2015）14-0180-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.029

2014－09－26

刘晓蓉（1973-），女，博士研究生，研究方向：食品生物技术。

林俊芳（1962-），男，博士，研究员，研究方向：生物活性天然产物。

国家自然科学基金项目（31272217）；农业部能源植物资源与利用重点实验室开放课题。