火炭母总黄酮的提取和抗氧化活性研究

董艳辉

（广东药学院医药化工学院，广东中山528458）

火炭母总黄酮的提取和抗氧化活性研究

董艳辉

（广东药学院医药化工学院，广东中山528458）

对火炭母总黄酮的提取工艺及抗氧化活性进行了研究。在单因素实验的基础上考察了料液比、乙醇浓度、提取时间、提取温度对总黄酮提取的影响，再通过正交实验确定提取的最佳工艺为：料液比1∶50g/mL、乙醇浓度50%、提取温度70℃、提取时间20min。在此条件下，火炭母总黄酮的提取率为4.28%。抗氧化结果表明，火炭母黄酮具有较强的还原能力，对DPPH·和OH·两种自由基具有明显的清除能力，且在实验浓度范围内清除率与浓度呈现出良好的量效关系，半数有效浓度EC50分别为0.00519、0.150mg/mL。

火炭母，总黄酮，提取，抗氧化活性

黄酮类化合物具有多种多样的生物活性，一方面通过其清除自由基的作用，直接抑制癌细胞的生长、从而提高机体免疫力而实现抗癌、防癌的作用，另一方面，该类化合物还能有效地阻止脂质过氧化引起的细胞破坏，起到天然抗氧化剂的功效［1］。近年来，黄酮类化合物在医药、食品领域的应用越来越广泛，从我国丰富的植物资源中开发利用黄酮类化合物已成为了研究热点［2-6］。

火炭母为蓼科蓼属植物火炭母的干燥全草，具有清热利湿、凉血解毒、平肝明目、活血通络等功效，是岭南地区常用的一味中草药，也是多种凉茶如“广东凉茶”、“王老吉”及“二十四味”等的主要组成药物之一。火炭母主要化学成分为黄酮类、鞣质类、甾醇类等［7-8］。韦玉、朱华等对不同产地火炭母的总黄酮和槲皮素含量进行了测定，发现火炭母含有丰富的黄酮和槲皮素［9-10］。黄国霞以甲醇为溶剂对火炭母的活性成分进行了提取，并且采用H2O2/Fe3＋体系法和邻苯三酚体系法对提取物的抗氧化活性进行了研究，所得结果显示火炭母甲醇提取液具有一定的抗氧化作用［11］。本研究以乙醇为溶剂，利用超声波辅助提取火炭母中的总黄酮，通过还原能力及清除自由基的能力考察火炭母总黄酮的抗氧化活性，旨在找到最佳的提取工艺及了解其抗氧化活性，以便人们对火炭母有更充分的认识，从而使其开发利用更加科学合理。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

火炭母中山市中智大药房；芦丁对照品中国药品生物制品检定所（批号：100080-200707）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH·） Sigma公司；其他试剂均为市售分析纯；实验用水蒸馏水。

UV1100紫外可见分光光度计上海天美公司；AUY220万分之一电子天平日本岛津公司；KQ3200 VDB型双频数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；HWS26型电热恒温水浴锅上海一恒科技有限公司。

1.2火炭母总黄酮的提取

1.2.1芦丁标准曲线的绘制总黄酮含量的测定采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法。精密称取干燥至恒重的芦丁标准品20mg，用无水乙醇溶解并定容于100mL容量瓶中，得到0.2mg/mL芦丁标准液。分别精密移取0.2mg/mL芦丁标准液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL于10mL容量瓶中，加水至5.0mL，加5%亚硝酸钠0.4mL放置6min，加10%硝酸铝0.4mL放置6min，再加4%氢氧化钠4mL，加水至刻度，摇匀，放置15min。以第1瓶为空白对照，于510nm波长下测定各溶液吸光度，吸光度（A）与芦丁标准溶液质量浓度（C）进行线性回归，得回归方程为A＝11.702C+0.0098，相关系数R2=0.9997。

1.2.2火炭母黄酮的提取火炭母经干燥粉碎后过60目筛，称取预处理后的火炭母粉末1.000g于具塞锥形瓶中，在不同条件下进行超声提取，提取液滤过后定容至100.0mL。精密移取已定容的火炭母提取液1mL于10mL容量瓶中，同1.2.1项测定方法，以试剂空白为参比液，于510nm波长处测定吸光度，根据制作的标准曲线算出黄酮提取率。

式中，A为吸光度；m为火炭母质量，g。

1.2.3单因素实验控制反应条件为温度40℃、乙醇浓度70%、超声提取时间30min，考察料液比分别为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60g/mL时的黄酮提取率。控制反应条件为温度40℃、料液比1∶50g/mL、超声提取时间30min，考察乙醇浓度分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%时的黄酮提取率。控制反应条件为温度40℃，料液比为1∶50g/mL，乙醇浓度40%，考察提取时间分别为10、20、30、40、50、60min时的黄酮提取率。控制反应条件为料液比1∶50g/mL、乙醇浓度40%、超声提取时间20min，考察超声提取温度分别为30、40、50、60、70℃时的黄酮提取率。

1.2.4正交实验设计在单因素实验的基础上，以料液比、乙醇浓度、提取温度、提取时间为实验因素，以黄酮提取率为指标，采用L9（34）正交表设计四因素3水平正交实验，具体方案见表1。正交实验结果采用SPSS 13.0统计软件处理，进一步筛选优化总黄酮提取工艺条件。

表1　正交实验因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal test

1.3火炭母黄酮抗氧化性活性的测定

1.3.1还原能力实验本实验用的是铁氰化钾法［12］。精密移取火炭母提取液1mL，加入2.5mL（pH6.6，0.2mol/L）磷酸缓冲液和2.5mL 1%铁氰化钾溶液，50℃恒温水浴20min，迅速冷却，加入2.5mL 10%三氯乙酸溶液，3000r/min离心10min，取上清液2.5mL，加2.5mL蒸馏水，加入0.5mL 0.1%三氯化铁，静置10min，于700nm波长处测吸光度。以VC作阳性对照实验。

1.3.2DPPH·清除实验DPPH·清除能力的测定参考Enayat S［13］方法：精确称取DPPH·7.8mg，用无水乙醇溶解并定容至100mL棕量瓶，避光保存，其浓度为2×10-4mol/L。将各组反应液加入10mL容量瓶中，混匀，于室温、避光处静置30min后，分别测定其在517nm波长下的吸光度，按照下式计算DPPH·的清除率，并计算样液清除DPPH·的半数有效浓度EC50。用VC作为对照。

式中，Ai为2mL DPPH·+2mL黄酮提取液的吸光度；Aj为2mL无水乙醇+2mL黄酮提取液液的吸光度；Ao为2mL DPPH·+2mL无水乙醇的吸光度。

1.3.3OH·清除实验清除羟自由基的能力的测定用水杨酸捕获法［14］。测定时于若干比色管中加入2mmol/L FeSO4溶液1mL，6mmol/L水杨酸-乙醇1mL，黄酮提取液1mL（空白对照以蒸馏水代替总黄酮提取液），最后再加入6mmol/L H2O21mL启动反应，37℃水浴30min，在510nm测定吸光度，实验重复3次，求其平均值。由于样液本身具有吸光度，测其本底值时用蒸馏水代替过氧化氢，根据下式计算羟自由基清除率，并计算样液清除的半数有效浓度EC50。用VC作为对照。

式中，Ax为加入黄酮提取液后吸光度；Axo样液本底吸光度，未加显色剂H2O2；Ao为空白对照吸光度。

图1　料液比对火炭母黄酮提取率的影响Fig.1　The effect of material-liquid ratio on extracion rate for total flabonoids from Polygonum chinense

2　结果与分析

2.1单因素实验结果

2.1.1液料比对火炭母黄酮提取率的影响由图1可知，在料液比低于1∶50g/mL时，提取率随料液比的增加整体呈上升趋势，当料液比继续增加，总黄酮提取率不断下降。根据萃取理论，黄酮的溶出与萃取液的浓度梯度有关。料液比越高，梯度越大，溶出率越高。在一定范围内，溶剂量的增加，颗粒内的黄酮化合物分子与溶剂接触几率增加，火炭母总黄酮溶出的几率也相应增加，总黄酮提取率就会不断提高，料液比为1∶50g/mL时，火炭母黄酮提取率达到最大值。当料液比达到一定数值后，超声波的空化作用对火炭母粉末细胞破裂辅助程度有所下降，且火炭母黄酮类化合物分子的溶出也相应接近饱和，从而导致总黄酮提取率下降。料液比越高乙醇的消耗量越大导致浓缩时间变长。考虑到提取效率、溶剂成本选择1∶50g/mL为最佳料液比。

2.1.2乙醇浓度对火炭母黄酮提取率的影响由图2可知，随着乙醇浓度的升高，总黄酮提取量呈现先升高再下降的趋势，在乙醇浓度为40%时提取量达到最高，之后又逐渐降低。根据有机溶剂“相似相溶原理”，黄酮的溶出度与溶剂的极性和本身的极性相关，极性相似可达到最大溶出度。开始时提高乙醇浓度增加了溶剂对物料的渗透性和对细胞膜的破坏性，从而提高了火炭母黄酮化合物的溶解度，乙醇浓度为40%时原料提取比较完全。当乙醇浓度超过40%时，总黄酮提取率降低，这可能是因为超声波提取要求溶剂有一定的含水量，水分过低不利于超声波发挥作用，而且高浓度的乙醇也会使一些醇溶性色素和杂质溶出。乙醇浓度过低，提取不完全，提取率低；乙醇浓度过高，使其他醇溶性杂质的溶出增大，有效成分溶出减少。因此40%乙醇浓度最佳。

图2　乙醇浓度对火炭母黄酮提取率的影响Fig.2　The effect of ethanol concentration on extraction rate for total flavonoids from Polygonum chinense

2.1.3提取时间对样品黄酮提取率的影响由图3可知，在其他条件一定的情况下，提取时间不同，黄酮提取率也不同，当提取时间为20min时，黄酮提取率最高，为4.13%。提取时间过短，超声波能量没有与火炭母颗粒内部分子充分作用，故火炭母总黄酮不能充分溶出，随着提取时间的延长提取率从最大开始缓慢下降，可能是因为超声时间过长，使整个体系温度过高，从而导致火炭母黄酮类化合物的分子结构被破坏。因此，20min为最佳提取时间。

2.1.4提取温度对样品黄酮提取率的影响由图4可知，随着温度的升高，总黄酮提取率也随之增高，温度升至70℃时，黄酮提取最高。随着提取温度的升高，分子的运动速度加快，有效成分渗透和溶解速度加快，有利于总黄酮的溶出，有利于提取率的提高。但温度过高可能造成黄酮化学结构变化，同时杂质的溶出量增加，给后续操作带来不便，还会造成溶剂损失。因此，可将超声温度控制在70℃以内。

图3　提取时间对火炭母黄酮提取率的影响Fig.3　The effect of extraction time on the extraction rate for total flavonoids from Polygonum chinense

图4　提取温度对火炭母黄酮提取率的影响Fig.4　The effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids from Polygonum chinense

表2　正交实验设计及结果Table 2　Ddesign and results of orthogonal test

2.2正交实验结果

正交实验结果见表2。四个因素的极差排列顺序为RB＞RC＞RD＞RA，最佳工艺组合为A2B3C3D2，即料液比1∶50g/mL、乙醇浓度50%、提取温度70℃、提取时间20min，在此条件下，平行3次验证实验，测得火炭母总黄酮的提取率为4.28%。

2.3火炭母黄酮抗氧化活性的结果

2.3.1还原能力的测定结果还原能力的强弱，可以反应药物的潜在抗氧化性能，是体外抗氧化的一个重要指标，吸光度越大，还原力越强。在浓度0.02～0.10mg/mL范围内，分别对火炭母黄酮和VC进行还原能力的测定，结果见图5。由图5可知，在实验浓度范围内，火炭母黄酮的还原能力与浓度呈现良好的线性关系，相同浓度的火炭母黄酮的还原能力均比VC弱，当火炭母黄酮为0.0716mg/mL时，和0.049mg/mL的VC还原能力相当，表明火炭母黄酮具有较强的还原能力。

图5　火炭母总黄酮的还原能力Fig.5　Reduction ability of total flavonoids from Polygonum chinense

2.3.2DPPH·的清除能力结果由图6可知，在低浓度范围内，DPPH·清除率呈线性增长，当火炭母黄酮浓度为0.012mg/mL时，清除率达到80.95%，随后清除率缓慢增长，表明此时溶液中大部分的DPPH·均被清除。在低浓度范围内，火炭母提取液的DPPH·清除效果均比抗坏血酸好，浓度为0.016mg/mL时两者清除率基本相当，经过计算得出火炭母黄酮清除DPPH·的半数有效浓度EC500.00519mg/mL，VC的EC50= 0.00953mg/mL。

图6　火炭母总黄酮和VC对DPPH·的清除能力Fig.6　The scavenging activity of total flavonoids from Polygonum chinense and VCagainst DPPH·

2.3.3OH·的清除能力结果自由基是人体中最活泼，对人体危害最大的自由基［15］。火炭母黄酮和VC对羟自由基的清除率结果见图7。由图7可知，在实验浓度范围内，火炭母黄酮对OH·的清除作用始终表现为浓度依赖性，随着浓度的增大而升高，当浓度达到1.0mg/mL时，火炭母黄酮的OH·清除率为97.33%，其清除OH·能力十分显著。经过计算得出火炭母黄酮清除OH·的半数有效浓度EC50=0.150mg/mL，VC的EC50=0.479mg/mL。

图7　火炭母总黄酮和VC对OH·的清除能力Fig.7　The scavenging activity of total flavonoids from Polygonum chinense and VCagainst OH·

3　结论

采用乙醇浸提和超声波结合的方法提取火炭母黄酮，确定了提取的最佳工艺条件：料液比1∶50g/mL、乙醇浓度50%、提取温度70℃、提取时间20min，在此条件下提取率可达4.28%。抗氧化性实验表明，火炭母中黄酮化合物具有良好的还原能力和清除DPPH·、OH·的能力，在实验浓度范围内抗氧化能力和浓度呈现出良好的量效关系。综上，火炭母是具有潜力的天然氧化剂资源，将在医药和保健食品工业中拥有很好的开发应用前景。

［1］乌兰格日乐，白海泉，翁慧.黄酮抗氧化活性研究进展［J］.内蒙古民族大学学报：自然科学版，2008，23（3）：277-280.

［2］余世望.60种药食两用植物抗氧化作用研究［J］.食品科学，1995，16（11）：3-5.

［3］郑瑞生，封辉，戴聪杰，等.植物中抗氧化活性成分研究进展［J］.中国农学通报，2010，26（9）：85-90.

［4］曾冬明.腊梅花中黄酮类成分提取、纯化工艺及抗氧化作研究［D］.长沙：湖南中医药大学，2013.

［5］吴娜.艾蒿黄酮的提取分离纯化、结构鉴定及其抗氧化性研究［D］.武汉：华中农业大学，2008.

［6］田永大.花生壳总黄酮提取纯化工艺及其抗氧化性研究［D］.上海：华东理工大学，2011.

［7］王永刚，谢化伟，苏薇薇.火炭母化学成分研究［J］.中药材，2005，28（11）：1000-1001.

［8］叶美青.火炭母的化学成分及质量标准初步研究［D］.广州：暨南大学，2011.

［9］韦玉，高雅，张可锋.不同产地火炭母总黄酮含量的测定［J］.安徽农业科学，2011，39（6）：3265-3266.

［10］朱华，高雅，张可锋，等.不同产地火炭母槲皮素的含量测定方法研究［J］.中药药理与临床药理，2009，20（16）：557-559.［11］黄国霞，刘柳，汪青.火炭母有效成分的提取及抗氧化活性研究［J］.湖北农业科学，2011：50（12）：2490-2492.

［12］Zhao H，Chen W，Lu J，et al.Phenolic profiles and antioxidant activities of commercial beers［J］.Food Chemistry，2010，119：1150-1158.

［13］Enayat S，Banerjee S.Comparative antioxidant activity of extracts from leaves，bark and catkins of alix aegyptiaca sp［J］. Food Chemistry，2009，116：23-28.

［14］彭常安，李媛媛.葛花总黄酮的抗氧化作用研究［J］.安徽师范大学学报：自然科学版，2012，35（2）：163-166.

［15］王建英，任引哲，王迎新.氧自由基与人体健康［J］.化学世界，2006，47（1）：61-63.

Study on extraction and antioxidant activity of total flavonids from Polygonum chinense

DONG Yan-hui
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangdong Pharmaceutical University，Zhongshan 528458，China）

The ultrasonic extraction process and antioxidant activity of total flavonids from Polygonum chinense were studied.The effects of four factors on extraction rate for total flavonoids were discussed by single factor experiment including material-liquid ratio，ethanol concentration，extraction time and extraction temperature. The orthogonal experiment showed the optimum conditions were as follows：material-liquid ratio 1∶50g/mL，ethanol concentration 50%，extraction temperature 70℃，extraction time 20min.Under these conditions，the extraction rate of total flavonoids was 4.28%.The results of antioxidation showed that the flavonoids from Polygonum chinense had good reduction ability，and also had significant scavenging activity on DPPH·and OH·，the scavenging rates to free radicals were positive proportional to the flavonoids concentration.The EC50of scavenging activity to DPPH·was 0.00519mg/mL.The EC50of scavenging activity to OH·was 0.150mg/mL.

Polygonum chinense；total flavonoids；extraction；antioxidant activity

TS255.1

B

1002-0306（2015）14-0299-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.052

2014－09－15

董艳辉（1981－），女，硕士，实验师，研究方向：现代分析技术及应用。