响应面分析法优化假单胞菌产絮凝剂的培养条件

何建玲，杨双双，2，黄金田，*，周冰倩，3，董　　锐

（1.盐城工学院化学与生物工程学院，江苏盐城224051；2.安徽理工大学化学工程学院，安徽淮南232000；3.常州大学材料科学与工程，江苏常州213000）

响应面分析法优化假单胞菌产絮凝剂的培养条件

何建玲1，杨双双1，2，黄金田1，*，周冰倩1，3，董锐1

（1.盐城工学院化学与生物工程学院，江苏盐城224051；2.安徽理工大学化学工程学院，安徽淮南232000；3.常州大学材料科学与工程，江苏常州213000）

从油漆废水中分离得到一株具有较高絮凝活性的菌种FL-1，通过16sDNA凝胶电泳图鉴定菌种的种类为门多萨假单胞菌。然后采用单因素实验对培养基进行优化，分别考察了培养基的初始pH、碳氮源及温度对絮凝效果的影响。最后用响应面设计法对这四因素进行优化，得到最佳的培养条件为葡萄糖26.5 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，初始pH7.0，温度31℃。在此条件下的絮凝率的理论值为96.55%，实验验证值为95.19%。实验值与响应面预测值拟合情况良好，则说明通过响应面实验设计对FL-1培养条件的优化是有效的。

响应面法，假单胞菌，微生物絮凝剂，培养条件

微生物絮凝剂（Microbial flocculent，简称MBF）是由微生物本身产生且具有高效的絮凝活性的天然高分子物质，具有高效、无毒、易降解、无二次污染、应用范围广、价格低廉等优点，因而被人们广泛应用于污水处理、医药、食品等领域［1］。微生物絮凝剂的主要化学成分有糖蛋白、蛋白质、多糖和纤维素等物质。在20世纪70年代日本学者在研究肽酸酯生物降解时发现了微生物的培养液具有絮凝作用，因此研究开发出了微生物絮凝剂［2］。二十世纪九十年代，日本仓根隆一郎等从日本的旱田土壤中分离筛选出一株对膨胀性污泥等有絮凝的菌S-1［3-4］。我国对微生物絮凝剂的研究起步相对较晚，主要是针对絮凝剂产生菌的筛选分离和培养条件进行研究［5］。甘莉等［6］分别对培养基初始pH、培养基的组成、温度和通气量等条件进行了考察，得出适合该菌种产生絮凝剂的最适条件。目前微生物絮凝剂的研究还处于实验室阶段，工业应用的还不多，所以在未来有很大的发展前景［2］。

响应面法（Response surface methodology，简称RSM）是一种数学方法与统计方法相结合，对多个影响变量进行建模和分析的方法，最终确定出最优的条件。目前响应面法已经广泛的应用于化工、生物、医学等领域［7］。本实验是在已经获得较好的微生物絮凝菌的基础上，通过研究培养基的初始pH、碳氮源、温度、接种量等对絮凝活性的影响，分别设计单因素实验、响应面实验，以絮凝剂发酵液的絮凝率为响应值，对培养条件进行优化，最终得到最佳的培养条件。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

菌种江苏韩一模塑有限公司的油漆废水中筛选分离得到；分离/鉴定培养基牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1000 mL，pH7.0～7.2，121℃灭菌20 min；种子培养基牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1000 mL，pH7.0～7.2，121℃灭菌20 min；发酵培养基葡萄糖20 g，KH2PO42 g，K2HPO45 g，（NH4）2SO40.2 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，尿素0.2 g，酵母膏0.5 g，蒸馏水1000 mL，pH7.0～7.2，115℃灭菌20 min。

SW-CJ-1F型超净工作台苏州净化设备有限公司；SHP-160生化培养箱上海三发科学仪器有限公司；AUY220型电子天平日本SHIMADZU公司；20～200 μL、100～1000 μL移液枪德国Eppendrof公司；LDZX-50KBS型立式高压蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂；CT15RT型台式高速冷冻离心机上海天美科学仪器有限公司；HYG-A型全温摇瓶柜太仓市强乐实验设备有限公司；UV752N型紫外-可见分光光度计上海佑科仪器仪表有限公司。

1.2实验方法

1.2.1絮凝率的测定在150 mL锥形瓶中加入50 mL 4 g/L的高岭土悬浊液，用1 mol/L NaOH溶液调节pH至8左右，在加入1%CaCl2溶液作为助凝剂，摇匀后，加入2 mL发酵液，快速振荡1 min后静置10 min，用移液枪吸取液面下2 cm处上清液，在紫外-可见分光光度计上测定波长在550 nm处的吸光度（OD550nm）。以等量蒸馏水代替发酵液作为对照。絮凝率的计算公式如下：

絮凝率（%）=（A-B）/A×100

其中，A—空白上清液的吸光度；B—样品上清液的吸光度［8］。

1.2.2生长曲线的测定取待测的发酵液在紫外-可见分光光度计上测定波长在600 nm处的吸光度（OD600nm），空白样为未接菌株的发酵液，测得的OD600nm即为生长值［9］。

1.2.3菌种的分离纯化100 mL种子培养基装入250 mL三角瓶中，灭菌后在无菌环境下将取回来的废水用移液枪吸取100 μL接种于三角瓶中，37℃恒温扩大培养24 h后，然后将培养液分别稀释到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍，再将各个稀释后的菌悬液涂布于分离培养基上，37℃恒温培养24 h后观察。根据菌落的形态，挑出菌落完成初步分离。再将挑出的各个菌接种于种子培养基，37℃恒温培养24 h后，对各个菌的培养液稀释并进行划线分离。这样反复培养划线对菌进行纯化，最后得到单菌落保存在分离培养基中［10］。

1.2.4菌种的筛选将分离出来的菌接种于种子培养基37℃培养24 h后，再将菌种子液按3%的接种量接种于发酵培养基中30℃培养72 h后，在4 g/L高岭土悬浊液中加入4%的量发酵液测定絮凝率，筛选出絮凝率较大的菌株。

1.2.5菌种的鉴定观察菌落表面形态、革兰氏染色，并且通过上海生工测定16sDNA凝胶电泳图鉴定菌种的种类［11］。

1.2.6单因素实验

1.2.6.1培养基的初始pH取250 mL的锥形瓶装入100 mL的发酵培养液，然后用1 mol/L NaOH溶液或HCl溶液将pH分别调节到2、3、4、5、6、7、8、9、10，灭菌冷却后，在无菌条件下接入3%的FL-1菌，在恒温摇床上30℃、160 r/min培养72 h，测定相对应培养液的絮凝活性，以不接菌的发酵液作对照，从而确定最佳的初始pH。

1.2.6.2培养基中的碳源在确定最佳pH的基础上，按20 g/L的量加入D-果糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、α-乳糖代替培养基中的碳源。在无菌条件下，不同的碳源培养基中接入3%菌种，30℃、160 r/min培养72 h，测定对应培养液的絮凝活性，以不接菌种的发酵液作对照，进而确定最佳碳源。

1.2.6.3培养基中的氮源在确定最佳初始pH和碳源的基础上，不改变发酵培养基中其他成分的情况下，分别按0.4 g/L硝酸铵、0.4 g/L氯化铵、0.2 g/L硫酸铵、10 g/L蛋白胨、0.2 g/L尿素、0.5 g/L酵母膏的量代替发酵培养基中的氮源。在无菌的条件下，接入3%的FL-1菌种于含100 mL培养基的250 mL锥形瓶中，30℃、160 r/min培养72 h，测定对应培养液的絮凝活性，以不接菌种的发酵液作对照，进而确定最佳氮源。

1.2.6.4培养温度在培养基初始pH和培养基成分不变的情况下，将温度分别调为25、30、35、37、40、45℃，观察其生长和絮凝情况来确定最佳温度。

1.2.7培养条件的优化实验设计根据上述单因素的实验结果，对其进行四因素三水平的响应面分析实验。因素与水平的编码见表1，并运用软件Design-Expert.V8.0.6进行实验设计以及数据分析，最终确定各影响因子对絮凝活性的影响程度以及最佳的培养条件。

表1　因素水平编码表Table 1　Factors and levels of response surface experiments

2　结果与分析

2.1菌种的鉴定结果

从油漆废水中分离筛选得到一株具有较高絮凝活性的菌株，对其鉴定结果见图1。由图1观察可知，FL-1为白色不透明凸起状菌落，表面光滑，边缘整齐，有粘性，革兰氏染色为阴性。

图1　FL-1菌落形态Fig.1　Colony of FL-1

采用RT-PCR对所分离细菌的16 SrDNA进行扩增，用于菌种鉴定。凝胶电泳结果见图2。根据16 SrDNA测序结果可以判断本文所分离的细菌与门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina LMG（GenBank序列号为Z76664）的置信度达到96%，因此，初步确定菌株FL-1属于Pseudomonas mendocina，命名为P.mendocina FL-1。

图2　FL-1菌株的16SrDNA凝胶电泳图Fig.2　Gel of 16SrDNA of strain FL-1

2.2单因素实验结果

2.2.1培养基的初始pH由图3可知，菌FL-1在pH7～9生长较好，絮凝率也较高，絮凝率分别达到92.4%、92.8%、93%，说明FL-1适合在pH为7、8、9的范围下生长，此时酶促反应速率快，生长和代谢速率也大。pH为7、8、9时，絮凝率差异不大，考虑培养基的成本和环境，选择pH为7作为培养基的初始pH。

2.2.2培养基中的碳源碳源为微生物的生长代谢提供能量及合成有机物质的骨架。不同的微生物所能产生的酶系不同，所利用的碳源也不同。由图4可知，菌FL-1对碳源的生长较为挑剔，对葡萄糖和果糖能有效的利用，并且葡萄糖和果糖所产菌的絮凝率分别达到91.1%和89%，而其他均低于55%，因此选用葡萄糖作为最佳碳源。

图3　培养基初始pH对菌FL-1的生长及絮凝率的影响Fig.3　Effect of initial pH on the growth and flocculating activity

图4　不同碳源对菌的生长及絮凝率的影响Fig.4　Effect of carbon sources on the growth and flocculating activity

2.2.3培养基中的氮源氮源分为有机和无机氮源。由图5可见，对于生长情况而言，无机氮源氯化铵、硫酸铵和有机氮源尿素的生长情况较好；对于絮凝情况而言，絮凝效果较好的是无机氮源硫酸铵和有机氮源蛋白胨和尿素，絮凝率分别是89.2%、93.6%、83.7%。因此鉴于培养基的成本，可以考虑混合氮源为硫酸铵、蛋白胨、尿素的组合。

2.2.4培养温度由图6可知，当温度为25℃时，菌生长较缓慢；当温度达到45℃时，高温导致菌体内代谢过程中的活性酶的活性降低，导致菌体不能利用营养物质生成自身生长所需的基础物质，自然也就不能产生絮凝剂；当温度在30～40℃时，发酵液在不同时间对高岭土悬液的絮凝效果也不同，但相比25℃和45℃生长状况和絮凝情况较好，并且30℃、72 h时絮凝率达到91.4%。综合考虑温度、时间和设备的要求，菌FL-1的发酵条件选为30℃下培养72 h。

2.3响应面分析及最佳培养基含量确定

根据单因素实验结果，选取葡萄糖、（NH4）2SO4、pH以及温度四个因素进行响应面实验设计，以葡萄糖20 g/L、（NH4）2SO40.5 g/L、pH7、温度30℃为实验中心点，其余成分的添加量保持不变，采用响应面实验优化培养条件，实验设计及数据分析结果见表2。

通过二次模型回归系数的计算，得到如下方程来表征四个因素对絮凝率的影响。

Y=-604.5085+7.96168X1+36.206X2+120.14317X3+ 10.22957X4+1.145X1X2-0.0055X1X3-0.02385X1X4+ 6.24X2X3-0.138X2X4-0.19X3X4-0.14591X12-111.88933X22-8.24058X32-0.13022X42

图5　不同氮源对菌的生长及絮凝率的影响Fig.5　Effect of nitrogen sources on the growth and flocculating activity

图6　不同温度对菌的生长和絮凝率的影响Fig.6　Effect of temperature on the growth and flocculating activity

表2　响应面实验设计及结果Table 2　Response surface experimental design and results

响应面分析中对实验结果进行拟合的二次模型方差分析见表3。其中模型p值＜0.0001，说明模型极显著。且其决定系数R2=0.9988、调整系数R2Adj=0.9976、预测系数R2pred=0.9956，说明模型拟合度高，即絮凝率的实测值和预测值之间具有很好的拟合度，实验误差小，可以用作菌FL-1絮凝效果的理论预测。由表3也可知各因素的显著性。模型中因素X1、X2、X3、X4、X1X2、X1X4、X2X3、X3X4、X12、X22、X32、X42对絮凝率的影响极显著（p＜0.01）。一次项中各因素对絮凝率的影响显著性大小顺序是X1（葡萄糖）＞X3（pH）＞X4（温度）＞X2［（NH4）2SO4］。各响应面立体分析图见图7～图10。

图7是培养基中葡萄糖与硫酸铵投加量的交互作用对絮凝率的影响，其中初始pH与温度均取7和30℃。由图7可知，随着葡萄糖投加量的增加，（NH4）2SO4投加量一定的条件下，絮凝率随着葡萄糖投加量的增加呈现先升高后降低的趋势，可见葡萄糖对絮凝率影响很大；葡萄糖投加量一定时，絮凝率随着（NH4）2SO4投加量的增加也呈现先升高后降低的现象，但是变化幅度没有葡萄糖大。结合表3结果得到两个因素的交互影响极显著（p＜0.01）。在图7中，响应值有一个高点，即葡萄糖投加量为30 g/L左右，（NH4）2SO4投加量在0.5 g/L左右，絮凝率达到最大。

表3　实验各因素主效应分析结果Table 3　Analysis of major effects for various factors of experiment

图7　葡萄糖与硫酸铵的响应面图Fig.7　Response surface stereogram versus glucose and（NH4）2SO4

图8　pH和硫酸铵的响应面图Fig.8　Response surface stereogram versus pH and（NH4）2SO4

图9　葡萄糖和温度的响应面图Fig.9　Response surface stereogram versus glucose and temperature

图10　温度和pH的响应面图Fig.10　Response surface stereogram versus temperature and pH

图8是pH和硫酸铵投加量交互作用对絮凝率的影响，其中葡萄糖与温度取30 g/L和30℃。从图8上可以看出，当一个因素不变时，絮凝率均随着另一个因素的增加先升高再降低。说明pH和（NH4）2SO4投加量交互作用明显，絮凝率也呈现先升高再降低的趋势，中间水平存在一个最高点。因此，当pH为7左右，（NH4）2SO4投加量控制在0.45～0.55 g/L，即可获得较高的絮凝率。

图9是葡萄糖投加量和温度交互作用对絮凝率的影响，其中（NH4）2SO4投加量和pH取0.5 g/L和7。当温度一定时，絮凝率随着葡萄糖投加量的增加先升高再降低；而当葡萄糖投加量一定时，絮凝率也随着温度的升高呈现先升再降的过程，但比较两个因素，葡萄糖的影响更大。两个因素存在交互作用，絮凝率在葡萄糖投加量为30 g/L，温度为29～33℃之间能达到最大值。

图10是温度和pH交互作用对絮凝率的影响，其中葡萄糖与（NH4）2SO4投加量为30 g/L和0.5 g/L。絮凝率随着温度和pH的增加均呈现先升高再降低的现象，说明两个因素存在一定的交互作用。絮凝率也在二者的交互作用中，在温度29～31℃，pH6.5～7.5之间可以达到最高点。

2.4参数优化结果及验证

对四个参数进行优化，参数取值范围是：葡萄糖20～40 g/L，（NH4）2SO40.25～0.75 g/L，pH6～8，温度25～35℃，絮凝率为60.2%～100%。优化后，在葡萄糖26.45 g/L，（NH4）2SO40.48 g/L，pH7.1，温度31.42℃条件下，预测的絮凝率高达96.55%。根据综合考虑及对设备和技术的要求，得到优化后的培养条件为葡萄糖26.5 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，pH7.0，温度31℃，在此条件下进行验证，测得絮凝率达到95.19%，比预测值低1.36%。说明响应面法的得到的最佳培养条件的数据是真实可靠的，因此响应面分析法具有可行性。

3　结论

鉴定了絮凝剂产生菌FL-1为门多萨假单胞菌，并研究了其在不同的培养条件下的产絮凝剂的能力，以生长及絮凝率为指标，确定培养基的初始pH、碳氮源及温度；通过爬坡实验、响应面实验，得到的最优培养条件为葡萄糖26.5 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，pH7，温度31℃，在此条件下的絮凝率的理论值为96.55%，实验验证值为95.19%。

［1］马放，李淑更，金文标，等.微生物絮凝剂的研究现状及发展趋势［J］.工业用水与废水，2002，33（1）.

［2］汪德生，张洪林，蒋林时，等.微生物絮凝剂发展现状与应用前景［J］.工业水处理，2004，24（9）：9-12.

［3］樊艳春，林波.微生物絮凝剂絮凝机理研究进展［J］.江西化工，2006（3）：1-4.

［4］陶明煊，吕丽爽.微生物絮凝剂应用现状［J］.环境监测管理与技术，2005，17（2）：14-16.

［5］孙鹏轩.微生物絮凝剂的研究进展及应用现状［J］.环境保护与循环经济，2013（1）：53-55.

［6］甘莉，孟召平.微生物絮凝剂的研究进展［J］.水处理技术，2006，32（4）：5-9.

［7］王永菲，王成国.响应面法的理论与应用［J］.中央民族大学学报：自然科学版，2005，14（3）：236-240.

［8］程金平，郑敏，张兰英，等.微生物絮凝剂絮凝活性研究［J］.世界地质，2000，19（1）：98-100.

［9］高颖，褚维伟，张霞，等.猪粪除臭微生物筛选及其生长曲线测定［J］.山地农业生物学报，2011，30（1）：47-51.

［10］骆克峻.聚合物降解菌的筛选评价及在油田污水生化处理中的应用［D］.青岛：中国海洋大学，2008.

［11］陶然，杨朝晖，曾光明.微生物絮凝剂产生菌的筛选，鉴定及培养条件和工艺的优化研究［D］.长沙：湖南大学，2006.

Optimal culture conditions for Pseudomonas flocculant using response surface analysis

HE Jian-ling1，YANG Shuang-shuang1，2，HUANG Jin-tian1，*，ZHOU Bing-qian1，3，DONG Rui1
（1.Institute of Chemical and Biological Engineering，Yancheng Institute of Technology，Yancheng 224051，China；2.Institute of Chemical Engineering，Anhui University of Science and Technology，Huainan 232000，China；3.Institute of Materials Science and Engineering，Changzhou University，Changzhou 213000，China）

FL-1 bacterium was isolated from waste water，it had high flocculating activity.It was identified as Pseudomonas mendocina by 16sDNA gel electrophoresis figure.Then single factor experiments were adopted to optimize the cultural conditions，including pH，arbon nitrogen source and temperature.At last，response surface analysis was used to optimize above mentioned four factors.The optimum culture conditions were determined as follows：initial pH of 7.0，glucose concentration of 26.5 g/L，（NH4）2SO4concentration of 0.5 g/L，cultivating temperature of 31℃.Under this culture conditions，the theoretical value of the flocculation rate was 96.55%，and the test value was 95.19%.These results indicated that the experimental results were totally in accordance with the predictive results of response surface analysis which was a valid method to optimize the culture conditions of FL-1.

response surface analysis；Pseudomonas sp；microbial flocculant；culture conditions

TS201.2

A

1002-0306（2015）16-0183-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.029

2014－12－08

何建玲（1963-），女，硕士，副教授，研究方向：应用化学，E-mail：hjlyc@126.com。

黄金田（1957-），男，本科，教授，研究方向：海洋生态学，E-mail：hjt@ycit.cn。

苏北科技发展计划——科技富民强县项目（BN2014049）。